[发明专利]一种β-半乳糖苷酶的固定化方法

权利要求书

1.一种β-半乳糖苷酶的固定化方法，其特征在于以细菌纤维素/海藻酸钠复合凝胶为固定化载体，包括固定化载体的制备和固定化β-半乳糖苷酶的制备，其中固定化载体的制备包括种子培养，细菌纤维素凝胶的制备，细菌纤维素凝胶的处理、打浆和细菌纤维素/海藻酸钠混合液的制备；

固定化载体的制备通过以下步骤实现：

（1）种子培养：取活化的木醋杆菌CGMCC No.1.1812斜面种子，接入在HS培养基中，在30℃下，160r/min，培养24h；

（2）细菌纤维素凝胶的制备：以2-10%的接种量接入装有HS培养基的发酵容器中， 30℃下培养2-6d，形成细菌纤维素凝胶；

（3）细菌纤维素凝胶的处理、打浆：细菌纤维素凝胶用水冲洗，再将其浸泡于0.1mol/l的碱液中，100℃煮沸6h，再用蒸馏水或0.1mol/l的醋酸溶液冲洗，直至pH值为7.0，然后细菌纤维素凝胶湿重与磷酸盐缓冲液以质量/体积之比为1:1的比例置于打浆机中，转速为300-1000r/min，时间为5-15min，形成细菌纤维素乳浊液；

（4）细菌纤维素/海藻酸钠混合液的制备：将海藻酸钠和细菌纤维素乳浊液以质量/体积之比为1:14的比例进行混合，水浴加热，边加热边搅拌，至海藻酸钠完全溶解，室温至冷却；

固定化β-半乳糖苷酶的制备方法为：量取细菌纤维素/海藻酸钠混合液20-30ml，与20-30ml的β-半乳糖苷酶均匀混合，然后用注射器吸取混合液滴入氯化钙溶液中，充分反应2-6h，洗涤、离心、真空干燥得固定化β-半乳糖苷酶。

2.根据权利要求1所述的一种β-半乳糖苷酶的固定化方法，其特征在于步骤（2）中所述培养方式为静置培养或振荡培养。

3.根据权利要求1所述的一种β-半乳糖苷酶的固定化方法，其特征在于步骤（3）中，所述碱液为NaOH、KOH、Na₂CO₃和K₂CO₃中任意一种，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.01-0.5mol/l、PH为5.0-8.0。

4.根据权利要求1所述的一种β-半乳糖苷酶的固定化方法，其特征在于所述β-半乳糖苷酶的浓度为0.25-2.0mg/ml，氯化钙的浓度为55.3g/L。

5.根据权利要求2所述的一种β-半乳糖苷酶的固定化方法，其特征在于步骤（2）中所述培养方式为静置培养时，培养方法为：以2-10%的接种量接入装有HS培养基的浅层发酵容器中，装液面高度为1-2cm， 30℃下静置培养2-6d，形成细菌纤维素凝胶；所述培养方式为振荡培养时，培养方法为：以2-10%的接种量接入装有HS培养基的发酵罐中，装液量为60-70%，30℃下振荡培养2-6d，转速为80-160rpm，形成细菌纤维素凝胶。

6.根据权利要求3所述的一种β-半乳糖苷酶的固定化方法，其特征在于步骤（3）中所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.1mol/l，pH为6.0。

7.根据权利要求5所述的一种β-半乳糖苷酶的固定化方法，其特征在于所述浅层发酵容器为托盘、锥形瓶或烧杯。

8.一种固定化β-半乳糖苷酶，其特征在于：以细菌纤维素/海藻酸钠复合凝胶为固定化载体；通过如权利要求1~7任一项所述β-半乳糖苷酶的固定化方法制备而成。