[发明专利]一种β-半乳糖苷酶的固定化方法

说明书

本发明提供一种β‑半乳糖苷酶的固定化方法，以细菌纤维素/海藻酸钠复合凝胶为固定化载体固定β‑半乳糖苷酶，包括固定化载体的制备和固定化β‑半乳糖苷酶的制备，其中固定化载体的制备包括种子培养，细菌纤维素凝胶的制备，细菌纤维素凝胶的处理、打浆和细菌纤维素/海藻酸钠混合液的制备。本发明制备得到的细菌纤维素/海藻酸钙复合凝胶固定化β‑半乳糖苷酶的酶活力回收率达到70～78％，最适pH偏碱性、增加至pH7.0～7.5，热稳定性提高、最适温度升高为40～45℃，米氏常数为9.5～10.5mmol/L，具有较好的稳定性和较高的应用价值。

技术领域

本发明涉及酶的固定化方法，尤其涉及一种β-半乳糖苷酶的固定化方法。

背景技术

β-半乳糖苷酶，全名为β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，简称为乳糖酶，广泛存在于各种动物、植物及微生物中，β-半乳糖苷酶由β-半乳糖苷酶基因编码，由4个亚基组成的四聚体，一般可催化乳糖分解为葡萄糖和半乳糖。

β-半乳糖苷酶的来源丰富，主要有细菌、霉菌、酵母等微生物，植物尤其是杏、扁桃和苹果，哺乳动物，特别是幼小哺乳动物的小肠中。其中微生物发酵制取β-半乳糖苷酶的生产成本低、产量高，周期短，所制取的酶源丰富，并且不受季节、地理位置的限制，在工业上得到广泛应用。

游离的β-半乳糖苷酶的制备方法简单，但是生产成本较高，对耐酸碱稳定性较低，从而β-半乳糖苷酶的应用受到限制。酶的固定化是通过物理或者化学的方法，将酶固定在载体上，形成固定化酶，使其既保持酶的天然活性，又便于与反应液分离，可以反复使用。固定化酶具有较高的酶活性、稳定性高，可反复使用，耐一定强度的酸、碱、热及有机溶剂。固定化β-半乳糖苷酶也有明显的优势，人们对β-半乳糖苷酶的固定化技术的研究做了大量的工作。

现有技术中，β-半乳糖苷酶的固定化方法主要有包埋法、吸附法、载体结合法和胶联法，常用的是单一方法或者两种或两种以上的方法结合使用，目前已报道的β-半乳糖苷酶固定化技术有纤维素包埋法，卡拉胶包埋法，聚丙烯酰胺包埋法；以壳聚糖为载体、戊二醛为交联剂，以明胶为载体、戊二醛为交联剂，以阳离子交换树脂为载体、戊二醛为交联剂相结合的方法；以凹凸棒吸附与壳聚糖包埋耦合的方法；海藻酸钠和卡拉胶相结合的方法。但是固定化载体的机械强度低，容易破碎或脱落，酶与载体的结合强度低。并且现有技术中没有涉及以细菌纤维素/海藻酸钠复合凝胶为固定化载体制取固定化β-半乳糖苷酶的方法。

发明内容：

本发明提供一种β-半乳糖苷酶的固定化方法，以细菌纤维素/海藻酸钠复合凝胶为固定化载体，通过交联剂交联β-半乳糖苷酶与细菌纤维素/海藻酸钠复合凝胶，增强复合凝胶的机械强度、亲水性和稳定性。

为达到上述目的，本发明通过如下技术方案来实现：

一种β-半乳糖苷酶的固定化方法，以细菌纤维素/海藻酸钠复合凝胶为固定化载体，包括固定化载体的制备和固定化β-半乳糖苷酶的制备，其中固定化载体的制备包括种子培养，细菌纤维素凝胶的制备，细菌纤维素凝胶的处理、打浆和细菌纤维素/海藻酸钠混合液的制备。

进一步，固定化载体的制备通过以下步骤实现：

(1)种子培养：取活化的木醋杆菌CGMCC No.1.1812斜面种子，接入在HS培养基中，在30℃下，160r/min，培养24h；

(2)细菌纤维素凝胶的制备：以2-10％的接种量接入装有HS培养基的发酵容器中，30℃下培养2-6d，形成细菌纤维素凝胶。

(3)细菌纤维素凝胶的处理、打浆：细菌纤维素凝胶用水冲洗，再将其浸泡于0.1mol/l的碱液中，100℃煮沸20min，再用蒸馏水或0.1mol/l的醋酸溶液冲洗，直至pH值为7.0，然后细菌纤维素凝胶湿重与磷酸盐缓冲液以质量/体积之比为1:1的比例置于打浆机中，转速为300-1000r/min，时间为5-15min，形成细菌纤维素乳浊液；