[发明专利]一种耐酸性苏氨酸生产菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种耐酸性苏氨酸生产菌的构建方法，其特征在于：以苏氨酸生产菌E.coli THRD保藏号CGMCC No.11074为研究对象，通过分子改造，在pTrc99A质粒上过表达谷氨酸氧化酶基因，或者整合谷氨酸氧化酶基因到E.coli THRD基因组，得到耐酸性苏氨酸生产菌株，具体步骤如下：

(1)合成谷氨酸氧化酶基因片段；

(2)将谷氨酸氧化酶基因及其表达载体pTrc99A用HindⅢ和BamHⅠ进行双酶切后连接，连接产物转化至E.coli THRD中；或者

利用Red同源重组基因敲除方法，整合谷氨酸氧化酶基因到E.coli THRD的阿拉伯糖基因araABD位点上；

其中，所述谷氨酸氧化酶的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示序列，所述阿拉伯糖基因araABD的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示序列，

所得表达谷氨酸氧化酶的基因工程菌即为耐酸性苏氨酸生产菌。

2.由权利要求1所述耐酸性苏氨酸生产菌的构建方法所获得的耐酸性苏氨酸生产菌，是在pTrc99A质粒上过表达谷氨酸氧化酶基因或者整合谷氨酸氧化酶基因到E.coli THRD基因组阿拉伯糖位点的耐酸性生产菌株。

3.权利要求2所述耐酸性苏氨酸生产菌在制备苏氨酸方面的应用。

4.根据权利要求3所述耐酸性苏氨酸生产菌的应用，其特征在于：制备苏氨酸的具体步骤如下：

(1)摇瓶发酵：①种子培养：将所述耐酸性苏氨酸生产菌从活化斜面上挑取2环接种于装有30-50mL种子培养基的500mL圆底三角瓶中9层纱布封口，置于旋转式摇床上，32-37℃，100-250rpm振荡培养6-10h；②摇瓶发酵：按5-10％接种量将步骤①中的种子培养物接入装有30-50mL发酵培养基的500mL挡板三角瓶中；以溴甲酚紫为指示剂在pH5.2，以溴百里酚蓝为指示剂在pH6.0条件下进行摇瓶发酵，发酵温度32-37℃，转速100-250rpm，发酵周期26-30h；

(2)发酵罐发酵：①种子培养：将8-10mL无菌水加入到3支活化斜面中制备菌悬液，将所有菌悬液接入装有1.5L种子培养基的5L发酵罐中，流加25％W/V的氨水调节发酵液pH至6.8-7.2，溶氧维持在30-50％，通风量3-5m³/h，搅拌转速200-600rpm，35-37℃培养6-8h；②发酵罐发酵培养：以10％-13％接种量将步骤①中的种子培养物接至装有3L发酵培养基的5L发酵罐进行发酵培养，发酵温度35-37℃，通风量3-5m³/h，搅拌转速300-1000rpm，溶氧维持在30-60％，流加浓度为60-80％W/V的葡萄糖溶液，维持残糖浓度为0.1-0.5％W/V；发酵前期流加25％W/V的氨水控制发酵液pH至6.8-7.2，发酵中后期流加25％W/V的氨水控制发酵液pH至5.8-6.2，发酵周期26-28h。

5.根据权利要求4所述的耐酸性苏氨酸生产菌的应用，其特征在于：所述活化斜面所使用的培养基为：葡萄糖0.5-1g/L，蛋白胨5-10g/L，牛肉膏2.5-5g/L，酵母粉2.5-5g/L，NaCl1-2.5g/L，琼脂条10-20g/L。

6.根据权利要求4所述的耐酸性苏氨酸生产菌的应用，其特征在于：所述步骤(1)、(2)中种子培养基成分为：葡萄糖15-25g/L，酵母粉5-10g/L，胰蛋白胨3-6g/L，(NH₄)₂SO₄ 1-2g/L，KH₂PO₄ 0.6-1.2g/L，MgSO4·7H₂O 0.3-0.5g/L，FeSO₄·7H₂O 5-10mg/L，MnSO₄·H₂O 5-10mg/L，B族维生素0.5-1mg/L，VH 0.15-0.3mg/L，所述B族维生素为VB₁、VB₃、VB₅、VB₇、VB₁₂。

7.根据权利要求4所述的耐酸性苏氨酸生产菌的应用，其特征在于：所述步骤(1)、(2)中发酵培养基成分为：葡萄糖25-40g/L，酵母粉1-2g/L，胰蛋白胨2-4g/L，柠檬酸钠0.5-1g/L，谷氨酸3-5g/L，KH₂PO₄ 1-2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4-0.7g/L，FeSO₄·7H₂O 30-50mg/L，MnSO₄·H₂O 30-50mg/L，B族维生素0.6-0.8mg/L，VH 0.1-0.2mg/L，所述B族维生素为VB₁、VB₃、VB₅、VB₇、VB₁₂，摇瓶中发酵培养基用稀硫酸调节初始pH值至5.2或6.0，发酵罐中发酵培养基初始pH值7.0,115℃灭菌20min。