[发明专利]一种耐酸性苏氨酸生产菌及其构建方法与应用

说明书

本发明提供了一种耐酸性苏氨酸生产菌的构建方法，并通过该方法获得的耐酸性苏氨酸生产菌可用于制备苏氨酸，利用谷氨酸氧化酶基因对谷氨酸进行脱氨反应，将其转化为α‑酮戊二酸，生成的游离NH₃和H₂O₂则可以中和胞内多余的质子从而提高菌体的耐酸能力，所述耐酸系统能够有效应用到生物产品的发酵生产中，该系统不会产生对菌体具有抑制作用的γ‑氨基丁酸或胍丁胺，不需要表达γ‑氨基丁酸或胍丁胺转运蛋白的基因，减少了重组菌株的负担；反应中生成的α‑酮戊二酸可以直接进入TCA循环，为菌体生长提供能量，有效减少液氨的用量，并且有效避免了pH波动对发酵造成的影响。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是一种耐酸性苏氨酸生产菌及其构建方法与应用。

背景技术

目前大肠杆菌具有三种已知的耐酸系统(ARs)。AR₁系统(一般也称为氧化系统)的机制仍然没有弄清楚，但可以确定的是它需要激活编码σS and CRP(cAMP的受体蛋白)的基因，并且被葡萄糖抑制。AR₂系统中包含谷氨酸(Glu)/γ-氨基丁酸(GABA)转运蛋白GadC和两个谷氨酸脱羧酶GadA和GadB。氨基酸转运蛋白GadC可以转换胞外Glu进入细胞内，与胞内的质子结合并在谷氨酸脱羧酶的作用下形成GABA，GABA再在GadC的作用下运输到胞外。类似AR₂系统，AR₃系统也由两部分组成，L-精氨酸(Arg)/胍丁胺(Agmatine)转运蛋白AdiC和精氨酸脱羧酶AdiA。精氨酸通过AdiC进入胞内，与质子结合并在AdiA作用下形成Agmatine，Agmatine再由AdiC运输到胞外。ARs系统在酸性条件下被激活，通过转移胞内质子增加pH值，提高大肠杆菌在酸性环境的生存能力。

在ARs系统的启发下，清华大学的研究人员构建了一个新型大肠杆菌耐酸性系统，通过表达氨基酸逆向转运蛋白GadC，酸性激活的谷氨酰胺酶YbaS将谷氨酰胺转化为谷氨酸盐同时释放游离NH₃，再结合AR₂系统提高大肠杆菌的耐酸能力。这种YbaS和GadC可被酸性pH激活，且只在pH6.0以下时才能适当发挥功能。

然而，现有的报道只是对大肠杆菌耐酸机制进行研究，并没有将其应用于生物产品的发酵生产中。同时通过AR₂或AR₃系统会产生对细胞具有抑制 作用的γ-氨基丁酸或胍丁胺，而且γ-氨基丁酸或胍丁胺排出到胞外也会影响到目的产物的分离提取。因此，依赖于AR₂或AR₃系统的耐酸性大肠杆菌无法真正应用于工业化规模的生产中。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种耐酸性苏氨酸生产菌的构建方法。

本发明所要解决的另一技术问题在于提供由上述耐酸性苏氨酸生产菌的构建方法所获得的耐酸性苏氨酸生产菌。

本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述耐酸性苏氨酸生产菌的应用，用于制备苏氨酸。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

一种耐酸性苏氨酸生产菌的构建方法，以苏氨酸生产菌E.coli THRD(保藏号CGMCC No.11074)为研究对象，通过分子改造，在pTrc99A质粒上过表达合成谷氨酸氧化酶基因，或者整合合成谷氨酸氧化酶基因到E.coli THRD基因组，得到耐酸性苏氨酸生产菌株。

优选的，上述耐酸性苏氨酸生产菌的构建方法，具体步骤如下：

(1)合成谷氨酸氧化酶(LGOX)基因片段；

(2)将谷氨酸氧化酶(LGOX)基因及其表达载体pTrc99A用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ进行双酶切后连接，连接产物转化至E.coli THRD中；或者