[发明专利]一种南极磷虾油中虾青素含量的测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种色谱检测的方法，具体涉及一种高效液相色谱法测定南极磷虾油中虾青素含量的方法，即C₁₈反相高效液相色谱分离，紫外检测器测定南极磷虾油中虾青素含量的方法。

背景技术

南极磷虾是地球上数量最大的单种生物资源。据联合国粮农组织1985年估算的数据，南极磷虾的总生物量约1.25～7.25亿吨，年可捕捞量约0.13～1亿吨，对于人口爆炸、食物资源短缺的当今世界，在全球海洋资源急速下降的大背景下，南极磷虾资源可以极大的缓解资源短缺等现状，因此南极磷虾受到世界各国的广泛关注。

南极磷虾油中含有虾青素、磷脂、ω-3多不饱和脂肪酸等活性物质。虾青素具有较强的抗氧化活性、抑制多不饱和脂肪酸的氧化、预防糖尿病、预防肿瘤、增强免疫力、促进生长繁殖等功效。因此磷虾油中的虾青素含量是评价南极磷虾油品质优劣的重要指标。

虾青素(astaxanthin)，3，3’-二羟基-4，4′-二酮基-β，β′-胡萝卜素，是一种酮式类胡萝卜素，分子式为C₄₀H₅₂O₄，分子量为596.86。南极磷虾油中的虾青素主要以虾青素酯的形式存在，游离虾青素占的比例较少，由于虾青素酯和游离虾青素的同分异构体种类较多，难以同时对各组分进行分离测定。而虾青素酯经皂化或酶解后可以完全转化为游离的虾青素，游离的虾青素主要有三种同分异构体:全反式虾青素，9-顺-虾青素，13-顺-虾青素，通过对游离虾青素的三种同分异构体进行分离测定，可以用于南极磷虾油中虾青素含量的测定。

虾青素的测定方法主要为分光光度法和高效液相色谱法，其中液相色谱法应用范围广、更加准确、有效。南极磷虾油的成分比较复杂，如果按照以前测定虾青素的方法测定南极磷虾油中虾青素，容易发生色谱柱堵塞现象，甚至导致液相色谱柱的损坏，所以传统的虾青素测定方法不适合南极磷虾油中虾青素的测定。有学者对南极磷虾油中虾青素进行提纯后再进行皂化反应，测量虾青素的含量，即认为是实际含量，但其忽略了提纯及皂化过程中，虾青素的损失，准确度较低。例如，采用BIO-3X填料的凝胶净化柱对南极磷虾油进行分离纯化，然后对虾青素酯皂化，使虾青素酯完全转化为游离虾青素，采用YMC-Caroteniod C₃₀色谱柱进行南极磷油中虾青素的定量。但是没有考察虾青素在皂化过程中的损失率，较真实值有所偏差。

针对以上问题，本发明方法不需对南极磷虾油进行纯化处理，较传统方法未有虾青素的损失；虾青素酯经过皂化得到游离虾青素过程中有所损失，因此本发明方法考察了虾青素的损失情况，引入加标回收率的步骤，计算皂化过程中加标回收率；由于加标回收率的引进，本方法虾青素的测定值更接近真实值。

发明内容

鉴于上述情况，本发明对南极磷虾油中虾青素酯的皂化后，直接采用Hypersil C₁₈色谱柱进行南极磷油中虾青素的定量，并引入了虾青素酯在皂化过程中的加标回收率的校正，客观真实地测定南极磷虾油中虾青素的含量，提高了南极磷虾油中虾青素含量测定的准确度。

本发明提供了一种高效液相色谱法测定南极磷虾油中虾青素含量的方法，该方法可以客观真实地反映虾青素含量。

本方法包括如下步骤：

S1、称取两份重量相同的南极磷虾油，每份0.2～0.5g，其中一份添加1ml虾青素标准品；所述虾青素标准样品来自法夫酵母提取，德国Dr.Ehrenstorferg公司生产，纯度≧97.1％。

S2、向上述南极磷虾油中加入4～6ml无水乙醇溶解，加入0.100～0.115mol/LNaOH-乙醇溶液2ml，定容到10～25ml，充氮后在4～25℃层析柜中进行皂化反应0.5～10h，使虾青素酯完全转化为游离虾青素；皂化完成后，加入0.100～0.105mol/L磷酸-乙醇溶液2～5ml终止反应；两份步骤S1所述南极磷虾油中各试剂的加入量均相同。

S3、涡旋混合后，离心取上清液，过0.22μm微孔滤膜，进行HPLC检测分析。