[发明专利]一种用于富集与分离糖蛋白的分子印迹复合材料的制备方法

说明书

本发明公开了一种用于富集与分离糖蛋白的分子印迹复合材料的制备方法，属于材料科学与工程和生物分离工程领域。该方法先将氧化石墨烯表面硼酸官能化，通过硼亲和作用将模板糖蛋白固定在氧化石墨烯表面，采用表面印迹技术在氧化石墨烯的表面形成蛋白质印迹层，洗脱掉模板得到分子印迹复合材料。该方法制备的分子印迹复合材料对模板糖蛋白具有非常好的专一性识别能力，另外还具有结合容量高、抗干扰能力强、结合和洗脱速度快的优点，可以用于对复杂的实际样品中低浓度的糖蛋白进行富集、分离与检测。

技术领域：

本发明公开了一种用于富集与分离糖蛋白的分子印迹复合材料的制备方法，属于材料科学与工程和生物分离工程领域。

背景技术：

糖蛋白是生物体内一类比较常见的蛋白质，具有重要的生物学功能和临床意义。糖蛋白在生理过程中具有重要作用，如分子识别、免疫应答及发育调控等，而且很多疾病的发生都与糖蛋白的表达有关，因此很多糖蛋白已经被用作临床诊断的疾病生物标记，用于重大疾病的早期诊断，如感染、肿瘤、心血管病、肝病、肾病及糖尿病等。胚胎抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)和前列腺特异抗原(PSA)等常见的疾病标志物都是糖蛋白。然而糖蛋白在体内的浓度较低，直接检测很容易受到干扰，因此一般对糖蛋白的检测需要有分离富集过程。目前，常用的凝集素和抗体是糖蛋白识别、纯化、分离的重要手段，然而它们有着价格昂贵、易失活以及与目标蛋白结合后洗脱困难等苦难，其他富集分离方法，例如尺寸排阻色谱、酰肼化学等，通常耗时耗力。因此，发展一种能够专一识别糖蛋白的价廉、稳定、洗脱方便、富集能力强的方法具有重要的应用前景。

分子印迹聚合物是将功能单体和交联剂围绕模板分子交联聚合而成的人工受体，在洗脱掉模板分子后，在其体内留下了与模板分子在尺寸大小、空间结构和结合位点互补的空穴，从而可用于模板分子的分离、富集及检测等。分子印迹聚合物不仅对目标分子具有较好的识别能力，还具有合成简单、成本低、稳定性好和可再生等优点。虽然分子印迹技术在小分子的印迹方面取得很大的进步，在对大分子特别是蛋白质的印迹方面还存在很多困难，这主要是因为蛋白质体积相比小分子化合物大，分子结构较为复杂，存在构象的差异变化，以及传统的分子印迹制备方法以有机相为溶剂，蛋白溶解性较差且容易失活等原因。为了解决这些问题，已发展出多种适用于蛋白质的分子印迹技术，如表面印迹法、纳米技术印迹、金属配位印迹法等。

表面分子印迹通过将分子识别位点设计在印迹材料表面或接近表面的地方，从而提升了识别位点与目标分子之间的传质作用，有利于模板分子的洗脱和再结合。石墨烯具有极高的比表面积、高热导率、快速的电子传递速率、良好的生物相容性及优良的机械性能等，是制备分子印迹材料很好的载体。以石墨烯为载体的分子印迹聚合物，功能单体的聚合过程发生在石墨烯片材的表面，制得的MIPs有极大的表面积，同时，识别位点分布于MIPs片层材料表面，能够有效的提高模板分子的吸附容量。不过石墨烯表面呈惰性，与蛋白质的亲和力有限，不利于蛋白质在其表面的结合与负载。最近，有研究发现在碱性条件下，苯硼酸结构可以和糖蛋白中的顺式二醇结构发生可逆的反应生成硼酸酯结构，形成稳定的苯硼酸.糖蛋白络合物，而在酸性条件下，硼酸酯键发生断裂，该苯硼酸.糖蛋白络合物破裂，释放出糖蛋白。这就使得苯硼酸修饰的分子印迹聚合物可以实现对糖蛋白的专一性识别及富集分离。并且，利用苯硼酸修饰的分子印迹聚合物对糖蛋白具有较高的亲和力，可以增强对特定糖蛋白质的选择性，并且，可以利用pH容易地控制结合/解吸过程。

本专利我们将以糖蛋白作为模板，结合表面印迹技术、纳米材料(石墨烯)与苯硼酸-糖蛋白亲和作用制备分子印迹复合材料，以石墨烯作为表面印迹聚合物的载体能够使结合位点位于材料表面并大大增加印迹比表面积，有利于提高结合容量和结合速度，另外氧化石墨烯表面硼酸基团的存在为糖蛋白提供了更有效的结合位点，特异性识别能力能够得到显著的提高，因此所得到的分子印迹复合材料同时具有专一性识别能力、抗干扰能力强、结合容量高、结合和洗脱速度快的优点，从而实现对复杂的实际样品中低浓度糖蛋白的富集与提纯。

发明内容：