[发明专利]一种检测人类前列腺癌特异性基因的环介导等温扩增试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种检测人类前列腺癌特异性基因的环介导等温扩增试剂盒，该试剂盒包括以下试剂：引物、2倍环介导等温扩增反应缓冲液、阳性对照、阴性对照、DNA聚合酶、逆转录酶和显色剂，所述的引物由一对外引物、一对内引物和一组环引物组成。本发明通过加入环引物显著提升反应速率，与PCR技术相比，检测时间减少约50%，在检测成本方面也较PCR明显减少。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种快速定性检测人类前列腺癌特异性基因PCA3的试剂盒及其应用。

背景技术

前列腺癌（Prostate cancer，Pca）是常见的泌尿系恶性肿瘤，据美国肿瘤学会报道，Pca在美国的发病率已经超过肺癌成为第一位，死亡率也高居第2。随着生活节奏的加快和饮食结构的西化，在我国及其他亚洲国家，Pca的发病率也在逐年升高，且发病年龄也趋于年轻化。早期诊断Pca可通过根治性切除术彻底治愈。因此，早期诊断对Pca的治疗和患者的预后至关重要。

目前在临床上仍根据前列腺特异性抗原（PSA）是否异常，指导前列腺穿刺活检用来诊断Pca，具有一定的应用价值，但是血清PSA为前列腺特异性抗原，只具备组织特异性而不具备肿瘤特异性。前列腺增生、前列腺炎等良性病变也可使PSA表达升高，导致许多患者遭受了不必要的活检，暴露出PSA在Pca诊断中的局限性。因此，探寻敏感性及特异性更加优越的Pca肿瘤标志物，对提高Pca的早期诊断有着十分重要的意义。

PCA3被认为是Pca的特异性基因，研究表明其在前列腺癌组织中高度表达，在正常前列腺组织或者前列腺增生组织中无表达或低表达，在其他肿瘤组织及器官中也无表达。但由于PCA3基因为非编码基因，不表达为蛋白质，检测起来有一定难度。目前用于检测PCA3基因最常用的方法为核酸扩增技术（PCR），虽然扩增结果稳定可靠，但检测时程长，成本较高，操作繁琐，不利于缺少技术设备的基层单位进行检测。

环介导等温扩增法（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）是一种新型的核酸扩增方法，它采用4条特异性引物及1条环引物识别靶基因，其可在等温条件下1小时可将目的序列扩增10^9倍以上。LAMP反应会产生大量的焦磷酸根离子，它们与LAMP反应体系中的镁离子（Mg2+）结合产生焦磷酸镁沉淀，引起浊度变化，十分便于观察，且整个扩增过程只需要一台水浴锅，大大加快了扩增进程并节省了实验成本。如在LAMP反应体系中加入钙黄绿素（一种荧光指示剂），那么在反应结束后会产生黄绿色荧光。不仅如此，随着LAMP技术的逐渐发展，实时浊度检测仪器也于今年来问世，将配置好的LAMP反应体系置于浊度仪上进行反应可实时观测浊度曲线，了解反应进程。

目前，公开的试剂盒反应体系不够稳定，不利于检测结果的快速获取且假阳性结果较多，因此使得该试剂盒的商业使用受到了限制。

发明内容

本发明通过设计合适的引物并优化检测条件，提供一种快速、定性检测人类前列腺癌特异性基因PCA3的试剂盒。该试剂盒包括以下试剂：引物、2倍环介导等温扩增反应缓冲液、阳性对照、阴性对照、DNA聚合酶、逆转录酶和显色剂，所述的引物由一对外引物、一对内引物和一组环引物组成，所述的引物序列如下：

F3(外引物)：TGGATATTTATTTGAACGGGAT；

B3(外引物)：AACGCACAGTTTAGGCAG；

LB(环引物)：GGGAGGAGATAACCACGGG；

FIP(内引物)：AGCCATCAAGATTTTCTCGTCTGTTTTTGAAATGAAGTCACAAAGTGAG；

BIP(内引物)：TGCAACAAACAAAATGGAATACTGTAGAATCCTGACCCTCTGC。

上述各引物量浓度分别为： FIP/BIP 40μM、 F3/B3 5μM、LB 20μM。