[发明专利]人扁桃体上皮细胞的分离培养与鉴定方法

权利要求书

1.人扁桃体上皮细胞的分离培养与鉴定方法，其特征在于：步骤如下：

一、实验准备：

(1)培养液配制:采用K-SFM培养基，加入表皮生长因子、牛垂体提取物、CaCl₂、青霉素-链霉素混合液和两性霉素，混匀，过滤，保存；

(2)培养瓶处理；向培养瓶中加入Type I/III胶原，以没过培养瓶底部为宜，在生物安全柜中避光通风过夜，次日在紫外灯下照射，保存备用；

二、分离培养

(1)扁桃体组织取材：在生物安全柜下将扁桃体组织置于盛有PBS平衡盐溶液的冰浴培养皿中，去除周边结缔组织，清洗，剪成组织块，并将其转移至dispase grade II溶液中；

(2)扁桃体组织分组消化：孵育过夜：在37℃孵育30min-1h，期间摇晃数次，然后放入4℃孵育过夜；

(3)扁桃体上皮细胞的分离：将消化好的组织块于次日经细胞筛过滤，细胞悬液离心、弃上清，细胞沉淀用胰酶消化液重悬、消化；然后加入含有血清的K-SFM培养基，中止消化，再离心、弃上清，最后用K-SFM培养基重悬，将原代细胞种入培养皿中，静置培养；

(4)形态学观察：将不同培养时间的扁桃体上皮细胞于倒置相差显微镜下进行形态观察，观察其形态及结构的变化，并进行比较；

(5)免疫荧光鉴定：包括细胞角蛋白13和细胞角蛋白8的鉴定：待培养皿中的细胞密度达到70％-90％，弃去培养液，加入固定液固定，弃去固定液后用Triton X-100通透化处理，然后用BSA封闭；加入一抗，过夜；加入荧光标记的二抗，后续步骤均需避光操作，室温孵育，然后用DAPI染色，在荧光显微镜下观察；

实验准备中，所述的培养液配制为：每200毫升K-SFM培养基，加入20-30微升表皮生长因子和4000-5000微升牛垂体提取物、150-250微升60mM的CaCl₂、2微升青霉素-链霉素混合液和200微升25mg/ml的两性霉素，混匀，然后经0.22微米滤膜过滤后，放置4℃保存；

实验准备中，所述的培养瓶处理为：向6孔板或者10cm培养皿中加入Type I/III胶原，以没过6孔板或者10cm培养皿底部为宜，生物安全柜中避光通风过夜，次日紫外灯下照射1-2小时，即可将6孔板或者10cm培养皿收起于4℃保存备用；

所述的扁桃体组织取材为：生物安全柜下将扁桃体组织置于盛有PBS平衡盐溶液的4℃冰浴的培养皿中，利用外科剪仔细去除周边结缔组织，用灭过菌的PBS清洗数次，剪成3mm×3mm大小的组织块，并将其转移至浓度为1-3mg/ml的dispase grade II溶 液中；

所述的扁桃体上皮细胞的分离为：消化好的组织块，于次日经220目的细胞筛过滤，细胞悬液1000rpm，离心5-10分钟；弃上清，细胞沉淀用胰酶消化液重悬，于37℃消化5分钟；然后加入含有10-15％血清的K-SFM培养基，中止消化，再1000rpm离心5分钟，弃上清，最后用角蛋白无血清培养基重悬，将原代细胞种入培养皿中，37℃，5％CO₂条件下静置培养，2-3天换液一次。

2.如权利要求1所述的人扁桃体上皮细胞的分离培养与鉴定方法，其特征在于：所述的胰酶消化液含0.05％-0.25％的胰酶和0.53mM的EDTA；所述的角蛋白无血清培养基含有5-10ng/ml EGF，20-30μg/ml BPE，0.06mM CaCl₂，1％青霉素-链霉素，25μg/ml两性霉素。

3.如权利要求1所述的人扁桃体上皮细胞的分离培养与鉴定方法，其特征在于：所述的免疫荧光鉴定包括细胞角蛋白13和细胞角蛋白8的鉴定：待培养皿中的细胞密度达到70％-90％，弃去培养液，用PBS洗两遍；加入4％多聚甲醛固定液，固定20min-30min，然后弃去固定液，PBS洗三遍，3min/次；室温条件下，用0.2％的Triton X-100通透化处理1h，PBS洗三遍，3min/次；室温条件下，5％BSA封闭30min-1h，PBS洗三遍，3min/次；加入1:200-1:300稀释的一抗，4℃过夜，PBS洗三遍，3min/次；加入荧光标记的二抗，后续步骤均需避光操作，室温孵育1h，PBS洗三遍，3min/次；DAPI染色3-5min，PBS洗三遍，3min/次；荧光显微镜下观察。