[发明专利]人扁桃体上皮细胞的分离培养与鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及人扁桃体上皮细胞的体外培养方法。

背景技术

扁桃体既是周围淋巴器官，又属于粘膜相关淋巴组织，具有复杂而特殊的隐窝管道系统，位于消化道和呼吸道共同入口处，是产生免疫应答的重要场所，其中隐窝上皮是该器官中最先接触抗原，潴留抗原，并产生免疫应答的位置，因此隐窝上皮是扁桃体行使免疫功能的重要组织屏障。然而在外界抗原的反复刺激下，常常引起慢性扁桃体炎和腺样体肥大的发生，其主要原因就是细菌和病毒的感染，越来越多的研究发现与EB病毒的感染，关系最为密切。但具体感染机制尚不明确，因此体外分离人扁桃体隐窝上皮细胞，能够更好的进一步探讨EB病毒的感染机制。

关于扁桃体上皮细胞的原代分离，国内尚没有相关文献报道，国外报道的扁桃体细胞分离方法主要集中在两种分离方法上，最早的一种方法是源于1990年华盛顿大学口腔生物系和药学系的研究，是关于口腔上皮细胞的无血清培养技术，属于酶消化法，成为后续扁桃体体外培养的很好的借鉴依据，但是各实验室的研究方法技术上存在一些差异而且不容易成功复制^[1]。另一种方法是2004年波士顿的塔夫茨大学医学院的研究，利用新鲜扁桃体的外植体，进行体外细胞迁移，并进行培养，但是此种方法，过程较为繁琐，分离周期较长，受个体差异影响较大，且容易污染^[2]。

1.Dolphine Oda,E.W.,Human oral epithelial cell culture I.Improved conditions for reproducible culture in serum-free medium.IN VITRO CELL DEV-AN,1990.26(6):p.589-595.

2.Pegtel,D.M.,J.Middeldorp,and D.A.Thorley-Lawson,Epstein-Barr virus infection in ex vivo tonsil epithelial cell cultures of asymptomatic carriers.J Virol,2004.78(22):p.12613-24..

发明内容

本发明的目的是对口腔上皮细胞的分离技术进行改进，探讨出了一种成功率较高、步骤简单、纯化率高的，几乎不会出现污染的扁桃体上皮细胞的体外分离及培养技术，对后续EB及其它病毒在扁桃体中的作用机制研究具有重要意义。

为达到上述目的,本发明提供的技术方案是：人扁桃体上皮细胞的分离培养与鉴定方法，其步骤如下：

一、实验准备：

(1)培养液配制：采用K-SFM培养基，加入表皮生长因子、牛垂体提取物、CaCl₂、青霉素-链霉素混合液和两性霉素，混匀，过滤，保存；

(2)培养瓶处理；向培养瓶中加入Type I/III胶原，以没过培养瓶底部为宜，在生物安全柜中避光通风过夜，次日紫外灯下照射，保存备用；

二、分离培养

(1)扁桃体组织取材：在生物安全柜下将扁桃体组织置于盛有PBS平衡盐溶液的冰浴培养皿中，去除周边结缔组织，用灭菌后的PBS清洗数次，剪成组织块，并将其转移至dispase grade II溶液中；

(2)扁桃体组织分组消化：孵育过夜；

(3)扁桃体上皮细胞的分离：将消化好的组织块，于次日经细胞筛过滤，细胞悬液离心、弃上清，细胞沉淀用胰酶消化液重悬、消化；然后加入含有血清的K-SFM培养基，中止消化，再离心、弃上清，最后用K-SFM培养基重悬，将原代细胞种入培养皿中，静置培养；

(4)形态学观察：将不同培养时间的扁桃体上皮细胞于倒置相差显微镜下进行形态观察，观察其形态及结构的变化，并进行比较；

(5)免疫荧光鉴定：免疫荧光鉴定包括细胞角蛋白13(CK13)和细胞角蛋白8(CK8)的鉴定：待培养皿中的细胞密度达到70％-90％，弃去培养液，加入固定液固定，弃去固定液后用Triton X-100通透化处理，然后用BSA封闭；加入一抗，过夜；加入荧光标记的二抗，后续步骤均需避光操作，室温孵育，然后用DAPI染色，在荧光显微镜下观察。