[发明专利]一种溶血性贫血患者外周血单核细胞的分离方法

权利要求书

1.一种溶血性贫血患者外周血单核细胞的分离方法，其特征在于：所述分离方法包括以下步骤：

1)取溶血性贫血患者外周血加入离心管中，低速离心，溶液分为三层，将顶层的富血小板血浆液面层除去；

2)往离心管中加入浓度为3％的明胶生理盐水溶液，对沉淀细胞进行重悬；

3)将重悬的细胞溶液自然沉淀60-70min，收集离心管中的明胶悬液层，并离心弃去上层清液；

4)往离心管中加入无血清培养基再次重悬细胞；

5)将重悬的细胞悬液加在淋巴细胞分离液的液面上，离心并将离心管中层白雾状细胞层转移到新的离心管中；

6)对白雾状细胞层进行离心，除上清，再加入PBS溶液，重悬洗涤，重复两次，加入无血清AIM-V培养基配置成悬液。

2.根据权利要求1所述的溶血性贫血患者外周血单核细胞的分离方法，其特征在于：所述步骤1)具体为：取溶血性贫血患者外周血加入离心管中，20℃，200×g离心10-20min，溶液分为三层，将顶层的富血小板血浆液面层除去。

3.根据权利要求1所述的溶血性贫血患者外周血单核细胞的分离方法，其特征在于：所述步骤2)中，加入的明胶生理盐水溶液和中间液面层的总体积与离心管底部沉淀层的体积比例为2-2.5:1。

4.根据权利要求1所述的溶血性贫血患者外周血单核细胞的分离方法，其特征在于：所述步骤3)中，先在20℃下，将重悬的细胞溶液自然沉淀60-70min，收集离心管中的明胶悬液层，然后将明胶悬液层在200×g的离心力下离心10min，弃去上层清液。

5.根据权利要求1所述的溶血性贫血患者外周血单核细胞的分离方法，其特征在于：所述步骤5)具体为：另一离心管中预先装入淋巴分离液，再将重悬的细胞悬液加在淋巴细胞分离液的液面上，重悬的细胞悬液和淋巴细胞分离液体积比为1-2：1，然后400×g离心30～40min，用吸管吸取离心管中的中层白雾状细胞层转移到新的离心管中。

6.根据权利要求1所述的溶血性贫血患者外周血单核细胞的分离方法，其特征在于：所述步骤6)具体为：所述白雾状细胞层450×g离心10min后去除上层清液，再加入PBS溶液，重悬洗涤，重复两次，加入无血清AIM-V培养基配置成悬液。