[发明专利]一种快速检测羊水中胎儿细胞VHL基因突变的方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及基因检测领域，尤其涉及羊水胎儿细胞VHL基因突变检测的方法和试剂盒。

背景技术

VHL基因(MIM编号608537)定位于3p25-26，全长10KD，包含三个外显子和两个内含子，可转录形成两种mRNA。包含三个外显子转录产物的mRNA翻译出p30(213个氨基酸)和p19(159个氨基酸)蛋白。p19是VHL基因第二转录起始位点(54号密码子)转录形成的异构体，与p30功能相似。

VHL基因突变方式多样，包括点突变、大片段缺失、小片段缺失或插入、剪切位点突变等。目前检测VHL基因突变最常用的方法是PCR直接测序，准确率为38％～80％，这是由于PCR测序检测技术只能检测点突变、小片段缺失或插入、剪切位点突变，不能检测VHL基因大片段缺失，然而VHL大片段缺失的发生率为11％～40％。目前国内外用于VHL基因大片段缺失检测的方法包括印记杂交法SouthernBlot、多重连接探针扩增技术MLPA、逆转录法RT-PCR及通用引物荧光定量PCR法UPQFM-PCR等。SouthernBlot和MLPA具有检测方法操作繁琐，价格昂贵，不适于推广应用等缺陷，且上述VHL基因突变的检测样本多为外周血，目前还没有对羊水中胎儿细胞的VHL基因进行检测的方法，一方面由于提取羊水时，羊水中可能会受到母体遗传物的污染，影响检测结果；另一方面，目前的应用于外周血等检测样本的VHL基因检测方法，检测周期长，检测成本高，不利于VHL基因的快速准确的检测。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的问题，提供一种操作简单、检测快速、结果准确且成本低廉的胎儿细胞VHL基因突变检测方法和试剂盒。

为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种快速检测羊水中胎儿细胞VHL基因突变的方法，包括：

通过提取羊水中胎儿细胞的DNA，获得DNA溶液；

对所述的DNA溶液进行母体遗传物质污染的检测，判断DNA溶液中是否存在母体遗传物质污染；

若判断DNA溶液中不存在母体遗传物质污染，则直接对胎儿细胞进行VHL基因突变检测；

若判断DNA溶液中存在母体遗传物质污染，则对羊水中胎儿细胞进行培养传代后再进行VHL基因突变检测。

其中，所述母体遗传物质污染检测包括：

人工合成人类性别决定基因SRY和X染色体上的3个短串联重复序列DXS6797、DXS6807、AR的扩增引物对1-4；

利用所述扩增引物对1-4和所述DNA溶液建立PCR扩增反应体系，进行PCR反应，得到PCR扩增产物；

对所述PCR扩增产物中的SRY基因扩增产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，对所述PCR扩增产物中的DXS6797、DXS6807和AR基因的扩增产物进行STR分析，根据所述SRY基因扩增产物的电泳结果和STR分析结果判断所述DNA溶液中是否存在母体遗传物质污染。

其中，所述利用所述扩增引物对1-4和所述DNA溶液建立的PCR扩增反应体系是：总体积为25μl，包括12.5μl的PCRmix、20-80ng的DNA模板、0.5μl的扩增引物和余量的ddH₂O；反应条件是：在95℃温度条件下预变性5min；95℃变性20s，SRY基因、DXS6797、DXS680755℃退火20s，AR58℃退火20s，72℃延伸20s，30个循环后72℃复性5min，4℃保存。

特别是，所述扩增引物对1-4如SEQIDNO.1-8所示，分别为：

扩增引物对1：SRY-F：5’-gagtgaagcgacccatgaac-3’

SRY-R：5’-tcttgagtgtgtggctttcg-3’

扩增引物对2：DXS6797-F：5’-ttccctctctccctctgtct-3’

DXS6797-R：5’-acacacacccaaaaccagat-3’

扩增引物对3：DXS6807-F：5’-gagcaatgatctcatttgca-3’

DXS6807-R：5’-aagtaaacatgtataggaaaaagct-3’

扩增引物对4：AR-F：5’-tccagaatctgttccagagcgtgc-3’

AR-R：5’-gctgtgaaggttgctgttctccat-3’

其中，所述扩增引物对2中DXS6797-F引物的5’端标记FAM荧光。