[发明专利]一种热启动Taq酶的热启动效率表征方法

说明书

技术领域

本发明属于Taq酶效率表征领域，特别涉及一种热启动Taq酶的热启动效率表征方法。

背景技术

聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)是常用的分子检测技术，PCR技术是将双链DNA作为模板，把单链寡核苷酸当作引物，通过热稳定的DNA聚合酶催化，经过热变性、退火、延伸三个步骤的重复循环，从而实现了在体外将特定的核苷酸片段进行指数级扩增的目的。PCR发生循环反应时对不同的循环步骤有不同的温度，要求的温度分别为变性(90℃左右)、退火(50℃左右)、延伸(70℃左右),多数酶在高温时就会变性失活。TaqDNA聚合酶(Taq酶)即便在90℃以上的高温中仍然保持活性，使得在循环步骤中不需要每个环节都加酶，从而使PCR反应的成本降低，Taq酶也成为PCR反应中最常用的DNA聚合酶^[2]。

TaqDNA聚合酶的最高生物学活性温度在70℃～75℃，然而PCR反应在升温时(20℃～70℃),TaqDNA聚合酶仍然有一定的聚合酶活性，容易使PCR反应发生引物二聚体以及非特异性的扩增，影响产物的特异性。因此如何在初始循环的热变性前将TaqDNA聚合酶活性抑制成为了现今的研究热点。研究发现可以通过对酶进行化学修饰、物理隔绝法、抗原抗体法、设计特殊的引物或者用基因工程的方法对酶进行结构改造来将TaqDNA聚合酶在未达到最适反应温度前的酶活抑制，实现热启动的目的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种热启动Taq酶的热启动效率表征方法，该方法中的热启动Taq酶，解决了使PCR反应发生引物二聚体以及非特异性的扩增，影响产物的特异性的问题。同时，该表征方法从多个角度进行验证，及对热启动效率进行半定量的评估，可以保证结果的可靠性。

本发明的一种热启动Taq酶的热启动效率表征方法，包括：

(1)在配制完成的PCR体系中，不加入dNTP，将该反应体系在PCR仪上完成热变性以后，加入dNTP作为对照；在另一加入修饰后热启动Taq酶的扩增体系中直接加入dNTP，进行同时扩增，反应结束后，用琼脂糖电泳检测PCR产物，比较两种操作中引物二聚体和非特异性扩增产物产生的情况，对热启动效率进行评估；

(2)通过不同的热变性时间对活性的影响，对修饰得到的热启动Taq酶的效果进行半定量的评估；

(3)经修饰得到的热启动Taq酶，在热变性的过程中释放活性，通过设定相同的热变性时间，检测不同的PCR体系中，累积相同的可被检测到的产物量所需要的循环数，对修饰的效果进行半定量的评估；

(4)通过比较普通Taq酶和热启动Taq酶在多重扩增中产物的差异，对修饰效果进行定量评估；

(5)通过设置不同的热变性时间的关系，比较普通Taq酶与热启动Taq酶的扩增能力恢复情况与热启动时间，对修饰效果进行评估。

所述步骤(1)中热变性(预变性)的条件为95℃，15分钟。

所述步骤(1)中扩增为热循环92℃15s,57.4℃1min,72℃1min,35个循环；补平72℃10min。

所述步骤(1)中反应在伯乐公司的PCR仪(MyCycler^TMthermalcyclerBio-Rad)上完成，每个体系设置3重复。

所述步骤(2)中热变性时间梯度为95℃，0-20min。

所述步骤(4)中多重扩增为预变性95℃2min和15min对照组；热循环92℃15s,60.1℃1min,72℃1min，35个循环；补平72℃10min。

由于经过人工的化学修饰或抗体结合，在常温下，其活性位点被封闭，不具有催化活性。而在PCR反应初期的热变性阶段，由于体系稳定上升到90℃以上，与活性位点氨基酸结合的化学基团或抗体与氨基酸的侧链基团解离后，活性位点暴露，恢复其DNA聚合酶活性，因而这样经过修饰的Taq酶被称为热启动Taq酶。其优点是避免了在常温下引物二聚体及非特异性扩增的产生。

对Taq酶的氨基酸序列及高级结构的分析发现，Taq酶中含有较多的带正电荷的氨基酸，本发明采用柠康酸酐与带有正电荷的氨基酸残基发生反应，暂时封闭Taq酶的活性结构域，阻止非特异性的扩增反应。本发明采用化学修饰的方法得到了热启动的Taq酶，但如何表征其热启动活性还没有明确的方法，本发明运用以下方法对化学修饰的热启动Taq酶进行了半定量的表征，为制备稳定，高效的热启动Taq酶提供了评判依据。

(1)手工热启动法