[发明专利]转基因玉米MON810双重数字PCR荧光定量检测方法

权利要求书

1.用于转基因玉米MON810双重数字PCR荧光定量检测的引物和探针组合，其特征在于，所述引物和探针组合为：

外源基因正向引物：5'-TCGAAGGACGAAGGACTCTAACGT-3'

外源基因反向引物：5'-GCCACCTTCCTTTTCCACTATCTT-3'

外源基因探针：5'-FAM-AACATCCTTTGCCATTGCCCAGC-BHQ1-3'

内参基因hmga正向引物：5'-TTGGACTAGAAATCTCGTGCTGA-3'

内参基因hmga反向引物：5'-GCTACATAGGGAGCCTTGTCCT-3'

内参基因hmga探针：5'-VIC-CAATCCACACAAACGCACGCGTA-BHQ1-3'。

2.含有权利要求1所述引物和探针组合的转基因玉米MON810双重数字PCR荧光定量检测试剂盒。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液、标准阳性模板中的至少一种。

4.转基因玉米MON810双重数字PCR荧光定量检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)提取待测样品的基因组DNA；

2)以提取的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的引物和探针组合，进行数字PCR扩增反应；

3)检测PCR扩增产物。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)中数字PCR扩增反应的反应体系以4μl计为：基因组DNA1μl，225nM外源基因正、反向引物各0.04μl，225nM内参基因正、反向引物各0.04μl，50nM外源基因探针0.02μl，50nM内参基因探针0.02μl，2×MasterMix2μl，20×LoadingReagent0.4μl，ddH₂O补足至4μl。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)中进行数字PCR扩增反应的程序为：50℃热激活300s；95℃预变性300s；95℃变性15s，60℃退火及延伸60s，共50个循环；在60℃下采集荧光信号。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在PCR芯片中进行数字PCR扩增反应。

8.根据权利要求4-7任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)中检测PCR扩增产物具体如下：在数字PCR扩增反应结束后，记录各反应孔中外源基因和内参基因的荧光信号值，通过泊松分布公式计算各反应孔中外源基因与内参基因的拷贝数，通过两者的拷贝数之比得到转基因成分的绝对浓度。