[发明专利]转基因玉米MON810双重数字PCR荧光定量检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学检测技术领域，具体地说，涉及转基因玉米MON810双重数字PCR荧光定量检测方法。

背景技术

自1996年首例转基因番茄在美国成功商业化以来，对于转基因作物的研究近二十年来取得了迅速的发展。根据ISAAA统计数据，截至2014年，全球转基因作物的种植面积已经达到1.8亿公顷，比1996年种植面积提高了近100倍，占全球作物种植总面积的3.4％。转基因作物的快速发展不仅为现代农业提供了更加便利的育种方式，也由于其未知的安全隐患引起了各个国家和地区的广泛关注。为此，各国家和地区纷纷建立起转基因成分的标识制度。在全球各国家和地区制定的转基因成分标识制度中，定量标识制度占据较大比重，其中以欧盟和日韩最具代表性。我国在转基因成分标识方面主要采取定性标识制度，由于定性标识制度与定量标识制度在检测技术等方面存在不同，使我国在作物进出口方面容易受到国际标准的制约。为此，我国需要大力发展转基因成分定量检测技术并建立相关定量标识制度。

数字PCR(Digital-PCR)是一种新型的绝对定量PCR检测方法，是一项检测和定量核酸的新技术，其基本原理是通过将微量样品进行大倍数稀释和分液，直至每个样品中所含有的待测分子数不超过1个，再将所有样品在相同条件下进行PCR扩增，有PCR扩增荧光信号记为1，无荧光信号记为0，有荧光信号的反应单元中至少包含一个拷贝的目标分子，针对反应结果采用泊松分布(Poissondistribution)公式，便可计算出样本的最初拷贝数或浓度。该技术不依赖于扩增曲线的循环阈值，也无需看家基因和标准曲线，即可实现DNA绝对定量。该技术在基因拷贝数变化分析(copynumbervariation,CNV)(Qinetal.,2008)、遗传突变检测(Yungetal.,2009)、基因分型(Loetal.，2007)、基因定量(Warrenetal.，2010)、单细胞基因表达(Guoetal.,2010)等方面的研究取得了突破性的发展，在临床方面为癌症、肿瘤等疾病检测提供了新的诊断方法。在转基因检测方面，Corbisier等(2010)利用数字PCR分析了玉米种子DNA中外源基因和内参基因的拷贝数之比，该结果与利用普通荧光定量PCR技术以质粒DNA为标准物质检测的结果相同，证明了数字PCR的可靠性。Burns等(2010)评估了数字PCR在转基因检测中检测限(LOD)和定量限(LOQ)，探索了数字PCR在转基因检测方面的可行性和反应条件，表明数字PCR能够对起始模板拷贝数进行绝对定量。然而利用数字PCR对转基因检测的研究还处于起步阶段。现有数字PCR检测方法都需要经过样品前处理过程，在实际检测中，前处理过程往往会导致实验结果产生偏差。因此现有的数字PCR检测方法不适合直接作为转基因成分的检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种不需要进行样品前处理步骤的，针对转基因玉米MON810的双重数字PCR荧光定量检测方法，可实现对转基因玉米品系MON810的绝对定量。

为了实现本发明目的，本发明首先提供用于转基因玉米MON810双重数字PCR荧光定量检测的引物和探针组合，所述引物和探针组合为：

外源基因正向引物：5'-TCGAAGGACGAAGGACTCTAACGT-3'

外源基因反向引物：5'-GCCACCTTCCTTTTCCACTATCTT-3'

外源基因探针：5'-FAM-AACATCCTTTGCCATTGCCCAGC-BHQ1-3'

内参基因hmga正向引物：5'-TTGGACTAGAAATCTCGTGCTGA-3'

内参基因hmga反向引物：5'-GCTACATAGGGAGCCTTGTCCT-3'

内参基因hmga探针：5'-VIC-CAATCCACACAAACGCACGCGTA-BHQ1-3'。

本发明还提供含有所述引物和探针组合的转基因玉米MON810数字PCR双重荧光定量检测试剂盒。

优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液、标准阳性模板等中的至少一种。

本发明进一步提供转基因玉米MON810双重数字PCR荧光定量检测方法，所述方法包括以下步骤：

1)提取待测样品的基因组DNA；

2)以提取的基因组DNA为模板，利用所述的引物和探针组合，进行数字PCR扩增反应；

3)检测PCR扩增产物。