[发明专利]一种免标记荧光探针及其在检测双倍体G‑四链体结构中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一类新型免标记荧光探针，以及其在细胞内外荧光检测双倍体G-四链体核酸二级结构中的应用。

背景技术

G-四链体（G-quadruplex）是一种特殊的DNA二级结构。人类基因组中很多富含鸟嘌呤（G）区域具有形成这一结构的能力，包括端粒末端鸟嘌呤重复序列，以及多种基因的启动子区域，如c-kit、c-myc、c-myb、bcl-2、PDGF、kRAS、VEGF、Rb和胰岛素基因等。最新研究表明，很多非编码区的RNA序列也可以形成G-四链体结构，RNA的G-四链体结构比DNA更稳定，该结构可能通过阻止基因的翻译或参与蛋白结合识别的过程而达到抑制肿瘤生长的效果。G-四链体结构的形成对于体内的一系列生理过程都存在调控作用。研究证明，某些启动子区域的G-四链体结构会显著影响基因的转录和翻译水平，因此G-四链体结构被认为是起到分子开关的功能，其形成和拆散可能涉及到信号传导、细胞凋亡和细胞增殖等一系列体内重要的生理过程。所以，在体内或者体外试验中，能够特异性地检测出G-四链体结构的存在或者形成，对于研究G-四链体结构的相关生物学功能以及开发以G-四链体结构为靶点的抗癌药物等方面都具有非常重要的作用。

目前，在体内和体外检测G-四链体结构的研究都取得了一些进展。由于体内大大过量的双螺旋DNA的存在，以及复杂的细胞内环境，使得体内的检测相对于体外检测需要解决更多的难题，目前已有一些荧光分子可以实现体内G-四链体结构的检测；体外实验中检测G-四链体结构主要是通过仪器的手段，比如圆二色谱法、核磁共振、表面等离子共振、荧光共振能量转移等方法，这些方法对仪器和技术操作的要求都较高，而且价格较昂贵，基本上不能普及使用。并且，目前大多数研究兴趣集中于对某一构象（如平行、反平行或混合性）的单倍体G-四链体结构的选择性和灵敏度检测，同时一个优良的荧光探针在检测靶向G-四链体的同时，不能影响靶向分子的构象和热稳定性，然而这样的荧光分子报道很少。

人端粒DNA是染色体末端由DNA重复序列TTAGGG组成的双螺旋区，其末端是含有100-200nt核苷酸的富含G碱基的单链悬突，该端粒DNA悬突为端粒酶的底物，端粒酶的激活和端粒的延长将导致肿瘤的发生。而这些富G的单链悬突，在一定的条件下可以形成复杂的由TTA碱基对序列连接的双倍体或者多倍体G-四链体结构，通过一些荧光分子实现对双倍体或者多倍体G-四链体结构的检测，对研究G-四链体结构的相关生物学功能以及开发以G-四链体结构为靶点的抗癌药物等方面都具有重要的作用。而目前对双倍体或多倍体G-四链体的荧光检测尚处于起步阶段，报道的荧光分子不多。

目前，只有文献报道单个的表小檗碱能够荧光检测存在于K⁺溶液中的混合型单倍体和多倍体G-四链体，且该荧光分子无法区分单倍体和多倍体G-四链体。

发明内容

针对双倍体G-四链体检测方面的空白，本发明提供了一类免标记的荧光探针，可在溶液中区分单倍体和多倍体G-四链体；并且还能够检测出细胞中的G-四链体。本发明探针不仅具有高灵敏度和选择性识别，且不影响G-四链体结构构象和热稳定性。

本发明目的在于提供醚链连接的对称小檗碱二聚体衍生物作为G-四链体结构检测探针的应用。

本发明所采取的技术方案是：

醚链连接的对称小檗碱二聚体衍生物，其分子结构如式I所示：

（I），其中n为2或3。

上述醚链连接的对称小檗碱二聚体衍生物作为G-四链体结构检测探针的应用。

进一步的，上述G-四链体DNA结构为双倍体G-四链体结构。

进一步的，上述的双倍体G-四链体结构为5’-A(GGGTTA)₇G₃-3’或5’-A(GGGTTA)₄(TTAGGG)₄-3’序列构成的双倍体G-四链体结构。

上述的醚链连接的对称小檗碱二聚体衍生物检测双倍体G-四链体结构的方法，其该方法为将待测DNA溶液中加入醚链连接的对称小檗碱二聚体衍生物溶液，混匀，检测混合液的荧光强度，若待测DNA溶液的荧光强度增强了至少160倍，说明待测DNA中含有双倍体G-四链体结构。

进一步的，上述待测DNA溶液的溶剂为含Na⁺的pH6.0～8.0的Tris-HCl缓冲液。

进一步的，上述醚链连接的对称小檗碱二聚体衍生物溶液的溶剂为含Na⁺的pH6.0～8.0的Tris-HCl缓冲液。