[发明专利]小鼠CRABP2基因真核表达载体的构建及应用

权利要求书

1.小鼠CRABP2基因真核表达载体的构建，其特征在于：包括以下步骤：

(1)、采用TRIzol法提取小鼠肌肉组织中的总RNA，合成cDNA第一链后，以合成的cDNA第一链为模板进行扩增，获得CRABP2基因；

(2)、将步骤(1)中扩增后获得的产物克隆到pGEM-Teasy载体，挑选阳性重组子测序，获得基因序列SEQIDNO:1，将测序获得的阳性重组子命名为pGEM-T-CRABP2；

(3)、将步骤(2)中的阳性重组子pGEM-T-CRABP2与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接、转化，得到小鼠CRABP2真核表达载体pcDNA3.1-CRABP2的重组质粒。

2.根据权利要求1所述的小鼠CRABP2基因真核表达载体的构建，其特征在于：所述步骤(1)扩增是采用RT-PCR扩增技术，且扩增CRABP2基因时，设计1对引物如下：

上游引物：5'ACTCAGCGTCCAGTGTTCTAG3'

下游引物：5'CGGAAGTCGTCTCAGGCAGT3'。

3.根据权利要求2所述的小鼠CRABP2基因真核表达载体的构建，其特征在于：两条所述引物的5'端分别加上EcoRV和NotI内切酶的酶切位点。

4.根据权利要求2所述的小鼠CRABP2基因真核表达载体的构建，其特征在于：将获得的CRABP2基因置于1.5％琼脂糖凝胶电泳、检测后于紫外仪下切割目的片段并使用凝胶回收试剂盒回收，回收产物克隆到pGEM-Teasy载体。

5.根据权利要求1所述的小鼠CRABP2基因真核表达载体的构建，其特征在于：所述步骤(3)，阳性重组子pGEM-T-CRABP2与真核表达载体pcDNA3.1(+))分别经限制性内切酶EcoRV和NotI双酶切进行连接后，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过抗性基因序列筛选，将阳性克隆采用PCR测序鉴定，获得小鼠CRABP2真核表达载体pcDNA3.1-CRABP2的重组质粒。

6.根据权利要求5所述的小鼠CRABP2基因真核表达载体的构建，其特征在于：所述抗性基因序列是pcDNA3.1(+)载体所包含的Amp抗性基因序列。

7.根据权利要求1～6任意一项所述方法构建得的小鼠CRABP2基因真核表达载体的应用，其特征在于：用于研究CRABP2基因在肌肉发育中的调控作用。

8.根据权利要求7所述的小鼠CRABP2基因真核表达载体的应用，其特征在于：包括如下步骤：

(1)、从所述小鼠CRABP2基因真核表达载体中挑选正确克隆的阳性菌株扩大培养，提取无内毒素质粒；

(2)、将步骤(1)获得的物质转染至C2C12细胞，于37℃培养4-6h后弃去转染混合液，加入含血清的DMEM生长培养基继续在37℃温度条件，CO₂为5％的培养箱内进行培养；

(3)、转染达3天后，收集细胞抽提RNA后验证分析小鼠CRABP2基因在C2C12细胞中表达情况。

9.根据权利要求8所述的小鼠CRABP2基因真核表达载体的应用，其特征在于：所述步骤(2)中，细胞融合度达到60％-70％时进行转染。