[发明专利]小鼠CRABP2基因真核表达载体的构建及应用在审
申请号: | 201510591834.9 | 申请日: | 2015-09-17 |
公开(公告)号: | CN105296519A | 公开(公告)日: | 2016-02-03 |
发明(设计)人: | 袁晶;陶恒勋 | 申请(专利权)人: | 长江大学 |
主分类号: | C12N15/66 | 分类号: | C12N15/66;C12N15/85;C12Q1/68 |
代理公司: | 武汉河山金堂专利事务所(普通合伙) 42212 | 代理人: | 胡清堂 |
地址: | 434023*** | 国省代码: | 湖北;42 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 小鼠 crabp2 基因 表达 载体 构建 应用 | ||
1.小鼠CRABP2基因真核表达载体的构建,其特征在于:包括以下步骤:
(1)、采用TRIzol法提取小鼠肌肉组织中的总RNA,合成cDNA第一链后,以合成的cDNA第一链为模板进行扩增,获得CRABP2基因;
(2)、将步骤(1)中扩增后获得的产物克隆到pGEM-Teasy载体,挑选阳性重组子测序,获得基因序列SEQIDNO:1,将测序获得的阳性重组子命名为pGEM-T-CRABP2;
(3)、将步骤(2)中的阳性重组子pGEM-T-CRABP2与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接、转化,得到小鼠CRABP2真核表达载体pcDNA3.1-CRABP2的重组质粒。
2.根据权利要求1所述的小鼠CRABP2基因真核表达载体的构建,其特征在于:所述步骤(1)扩增是采用RT-PCR扩增技术,且扩增CRABP2基因时,设计1对引物如下:
上游引物:5'ACTCAGCGTCCAGTGTTCTAG3'
下游引物:5'CGGAAGTCGTCTCAGGCAGT3'。
3.根据权利要求2所述的小鼠CRABP2基因真核表达载体的构建,其特征在于:两条所述引物的5'端分别加上EcoRV和NotI内切酶的酶切位点。
4.根据权利要求2所述的小鼠CRABP2基因真核表达载体的构建,其特征在于:将获得的CRABP2基因置于1.5%琼脂糖凝胶电泳、检测后于紫外仪下切割目的片段并使用凝胶回收试剂盒回收,回收产物克隆到pGEM-Teasy载体。
5.根据权利要求1所述的小鼠CRABP2基因真核表达载体的构建,其特征在于:所述步骤(3),阳性重组子pGEM-T-CRABP2与真核表达载体pcDNA3.1(+))分别经限制性内切酶EcoRV和NotI双酶切进行连接后,转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,通过抗性基因序列筛选,将阳性克隆采用PCR测序鉴定,获得小鼠CRABP2真核表达载体pcDNA3.1-CRABP2的重组质粒。
6.根据权利要求5所述的小鼠CRABP2基因真核表达载体的构建,其特征在于:所述抗性基因序列是pcDNA3.1(+)载体所包含的Amp抗性基因序列。
7.根据权利要求1~6任意一项所述方法构建得的小鼠CRABP2基因真核表达载体的应用,其特征在于:用于研究CRABP2基因在肌肉发育中的调控作用。
8.根据权利要求7所述的小鼠CRABP2基因真核表达载体的应用,其特征在于:包括如下步骤:
(1)、从所述小鼠CRABP2基因真核表达载体中挑选正确克隆的阳性菌株扩大培养,提取无内毒素质粒;
(2)、将步骤(1)获得的物质转染至C2C12细胞,于37℃培养4-6h后弃去转染混合液,加入含血清的DMEM生长培养基继续在37℃温度条件,CO2为5%的培养箱内进行培养;
(3)、转染达3天后,收集细胞抽提RNA后验证分析小鼠CRABP2基因在C2C12细胞中表达情况。
9.根据权利要求8所述的小鼠CRABP2基因真核表达载体的应用,其特征在于:所述步骤(2)中,细胞融合度达到60%-70%时进行转染。
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