[发明专利]小鼠CRABP2基因真核表达载体的构建及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种载体构建方法，具体地说是一种小鼠CRABP2基因真核表达载体的构建及应用。

背景技术

维生素A是人体生长发育及维持机体生命活动所不可或缺的一种微量营养素，它除了在细胞分化方面具有明确的作用以外，同时还参与如免疫反应、食欲和生长等许多其它生理生化过程。其中，其活性代谢物视黄酸通过调节许多目标基因的转录来调节细胞分化和增殖等许多生理生化过程，但要充分发挥此功能必须和相应的蛋白相结合，即细胞视黄酸结合蛋白(CRABPs)基因家族。

Tang等研究发现，CRABPs基因家族在猪胚胎发育不同时期的骨骼肌里呈现差异表达，而CRAPB2是CRABPs基因家族的一名成员。早期研究发现，在小鼠胚胎发育时期，该基因在多个组织器官都有表达，CRAPB2基因在胚胎发育过程中发挥重要作用，同时可能对肌肉发育起调控作用，而小鼠来源的骨骼肌细胞系C2C12，是用作研究体外肌细胞分化和肌肉发育常用的一种重要细胞模型。

在细胞水平上研究证明CRABP2基因参与骨骼肌的肌纤维分化和肌肉发育，首先需要研究CRABP2基因对C2C12细胞的作用，因此构建小鼠CRABP2基因的真核表达载体至关重要。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种小鼠CRABP2基因真核表达载体的构建以及该表达载体的应用。

一种小鼠CRABP2基因真核表达载体的构建，包括以下步骤：

(1)、采用TRIzol法提取小鼠肌肉组织中的总RNA，合成cDNA第一链后，以合成的cDNA第一链为模板进行扩增，获得CRABP2基因；

(2)、将步骤(1)中扩增后获得的产物克隆到pGEM-Teasy载体，挑选阳性重组子测序，获得基因序列SEQIDNO:1，将测序获得的阳性重组子命名为pGEM-T-CRABP2；

(3)、将步骤(2)中的阳性重组子pGEM-T-CRABP2与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接、转化，得到小鼠CRABP2真核表达载体pcDNA3.1-CRABP2的重组质粒。

优选地，所述步骤(1)扩增是采用RT-PCR扩增技术，且扩增CRABP2基因时，设计1对引物如下：

上游引物：5'ACTCAGCGTCCAGTGTTCTAG3'

下游引物：5'CGGAAGTCGTCTCAGGCAGT3'。

优选地，两条所述引物的5'端分别加上EcoRV和NotI内切酶的酶切位点。

优选地，将获得的CRABP2基因置于1.5％琼脂糖凝胶电泳、检测后于紫外仪下切割目的片段并使用凝胶回收试剂盒回收，回收产物克隆到pGEM-Teasy载体。

优选地，所述步骤(3)，阳性重组子pGEM-T-CRABP2与真核表达载体pcDNA3.1(+)分别经限制性内切酶EcoRV和NotI双酶切进行连接后，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，通过抗性基因序列筛选，将阳性克隆采用PCR和测序鉴定后，获得小鼠CRABP2真核表达载体pcDNA3.1-CRABP2的重组质粒。

优选地，所述抗性基因序列是pcDNA3.1(+)载体所包含的Amp抗性基因序列。

一种小鼠CRABP2基因真核表达载体的应用，用于研究CRABP2基因在肌肉发育中的调控作用。

优选地，小鼠CRABP2基因真核表达载体的应用，包括如下步骤：

(1)、从所述小鼠CRABP2基因真核表达载体中挑选正确克隆的阳性菌株扩大培养，提取无内毒素质粒；

(2)、将步骤(1)获得的无内毒素质粒转染至C2C12细胞，于37℃培养4-6h后弃去转染混合液，加入含血清的DMEM生长培养基继续在37℃温度条件，CO₂为5％的培养箱内进行培养；

(3)、转染达3天后，收集细胞抽提RNA后验证分析小鼠CRABP2基因在C2C12细胞中的表达情况。

优选地，所述步骤(2)中，细胞融合度达到60％-70％时进行转染。

本发明一种小鼠CRABP2基因真核表达载体的构建及应用，优点是：利用一对引物进行PCR扩增，克隆得到小鼠CRABP2基因的完整编码区，并成功构建小鼠CRABP2基因真核表达载体。该真核表达载体构建方法简单易行；验证CRABP2基因在转染后C2C12细胞中的表达，为研究该基因在肌肉发育中的作用奠定基础，同时为将来运用于遗传标记辅助育种提供重要依据。

附图说明