[发明专利]鉴定区分普通小麦春化基因VRN3等位基因的特异引物及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种鉴定区分普通小麦春化基因VRN3三个等位基因（VRN-A3、VRN-B3、VRN-D3）的特异引物及其应用。

背景技术

小麦作为最重要的粮食作物之一，其春化发育特性一直是小麦生理学领域研究的重要课题。其研究不但能揭示春化发育的生理机制和分子机理，补充完善春化作用的理论，更重要的是为培育高产、优质、广适性的小麦品种提供理论依据。

近年来，随着植物分子生物学的迅速发展，特别是小麦春化相关基因的挖掘，有关小麦春化发育的分子调控机制取得了新的进展。春化基因是决定小麦全生育期进度的重要基因，对小麦在不同环境条件下的适应性具有显著的影响。例如，冬小麦品种需要春化处理才能够正常的开花和成熟。根据春化基因（Vernalization，VRN）的等位差异，可将小麦划分为冬性、半冬性、春性。目前，普通小麦春化基因研究较多的有VRN1、VRN2和VRN3，其中VRN3是小麦开花调控途径中的关键基因，可以整合春化和光周期响应途径；Yan等已利用高密度图谱将VRN3定位于7B染色体的短臂上。研究发现VRN3基因序列高度保守，因而对其所含等位基因的分离与鉴定存在着极大的难度。

发明内容

本发明的目的在于提供一种鉴定区分普通小麦春化基因VRN3三个等位基因（VRN-A3、VRN-B3、VRN-D3）的特异引物及其应用，为研究VRN3三个等位基因的表达及对小麦春化发育特性的分子调控提供依据。

基于长期的研究实践经验，本发明采用了如下技术研究思路：

先以有代表性的不同春化发育特性普通小麦品种为试验材料，以VRN3-F1/VRN3-R1为引物（见表3），在基因组和cDNA上分别扩增VRN3基因，结合NCBI上的参考序列（GenbankaccessionnumbersEF428115.1，DQ890164.1，EF428113.1)和扩增得到的序列进行比对分析表明：每个品种的cDNA都扩增到一条452bp的片段，且不同品种间序列完全保守；进一步的研究分析表明，在不同小麦品种基因组中均存在VRN-A3、VRN-B3、VRN-D3三种序列，分别包含2个内含子和3个外显子，三个部分同源序列的外显子差异较小，只有少数单碱基突变，主要差异在第一内含子和第二内含子上，可根据内含子长度的差异来区分VRN3基因组上的三个部分同源序列。

本发明后续研究通过普通PCR扩增、RACE及site-findingPCR技术，经序列整合和比对分析，设计一对通用引物JF1和JR1，经PCR扩增得到VRN3的A、B、D基因组序列，分别为1724bp、1962bp和1723bp。为进一步区分VRN3基因的三个等位基因序列，研究设计了3个前引物、以JR1为后引物进行扩增：

前引物:

58A-F:5'-CCGGTCGATCTACACTAGGAAGA-3'，

67B-F1:5'-CGTACCCTAGCTAGCAAGGCAA-3',

70D-F2:5'-GCTCCAGAGAACCTCTGCTGC-3',

和后引物：

JR1:5’-AGAGAAGCCACCGGTCTCATAC-3’。

利用上述引物，以普通小麦品种的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，分别得到1660bp、1899bp、1687bp的片段，经序列比对分别为VRN-A3、VRN-B3、VRN-D3；通过在不同发育特性小麦品种上鉴定，均能有效地区分普通小麦春化基因VRN3中A、B、D三个等位基因。

本发明具有以下积极有益的技术效果：

1.经筛选研究，得到LC10、J841等不同发育特性小麦品种A、B、D基因组上VRN3基因的三个同源基因部分序列，并得到能有效鉴定区分不同发育特性小麦品种VRN3基因的三个等位基因的特异引物；

2.VRN3的A、B、D基因组分离与鉴定，对研究VRN3不同等位基因在春化进程中的表达具有十分重要的意义，为进一步明确该等位变异类型的分子机制，开发相应的分子标记提供了依据。

附图说明