[发明专利]一种弧菌通用的基因敲除自杀载体及其应用在审
| 申请号： | 201510593592.7 | 申请日： | 2015-09-16 |
| 公开（公告）号： | CN105063073A | 公开（公告）日： | 2015-11-18 |
| 发明（设计）人： | 罗鹏;何香燕;刘秋婷;胡超群 | 申请（专利权）人： | 中国科学院南海海洋研究所 |
| 主分类号： | C12N15/63 | 分类号： | C12N15/63;C12N15/03;C12N1/20 |
| 代理公司： | 广州科粤专利商标代理有限公司 44001 | 代理人： | 刘明星 |
| 地址： | 510301 *** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 弧菌 通用 基因 自杀 载体 及其 应用 | ||
1.一种基因敲除自杀载体pLP12，为环状载体，其特征在于，包括PBAD启动子、阻遏蛋白基因araC、RP4转移起始位点、氯霉素抗性基因、R6K复制起始位点、多克隆位点区和致死基因vmi480，所述的多克隆位点区至少包含两个AhdI酶切位点，所述的致死基因vmi480的核苷酸序列如SEQIDNO.1的第21-617位碱基序列所示，所述的致死基因vmi480位于PBAD启动子下游并处于PBAD启动子控制之下。
2.根据权利要求1所述的基因敲除自杀载体pLP12，其特征在于，所述的基因敲除自杀载体pLP12，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。
3.一种基因敲除自杀载体pLP12T，为线性载体，其特征在于，是将权利要求1所述的基因敲除自杀载体pLP12用AhdI酶切多克隆位点区中的两个AhdI酶切位点后得到的线性载体，即为基因敲除自杀载体pLP12T。
4.根据权利要求3所述的基因敲除自杀载体pLP12T，其特征在于，所述的基因敲除自杀载体pLP12T，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。
5.权利要求3所述的基因敲除自杀载体pLP12T在基因敲除中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的基因敲除自杀载体pLP12T在弧菌基因敲除中的应用。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，将目的基因的框内缺失融合片段与基因敲除自杀载体pLP12T连接，得到携带目的基因的框内缺失融合片段的pLP12T，命名为pLP12T-X，pLP12T-X经转化进入供体菌中，然后将此供体菌与受体菌混合，经接合作用将pLP12T-X转移进入受体菌，经氯霉素选择，获得pLP12T-X整合到受体菌基因组靶位点的目的基因插入突变型菌株，然后此目的基因插入突变型菌株在阿拉伯糖诱导vmi480基因产生毒素Vmi480的反向选择压力下，经过筛选获得目的基因缺失的克隆，从而达到将目的基因敲除，获得目的基因缺失的菌株。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的受体菌为弧菌。
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