[发明专利]一种弧菌通用的基因敲除自杀载体及其应用

说明书

技术领域：

本发明属于微生物遗传操作领域，具体涉及一种弧菌通用的基因敲除自杀载体及其应用。

背景技术：

弧菌是海洋环境中最为常见的异养细菌，至少有12种弧菌可引起人类致病，其中霍乱弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌对人类健康危害最为严重。此外不少种类的弧菌也是水产经济动物病原，其引发的弧菌病导致水产养殖大量经济损失。尽管很早已经发现了霍乱弧菌和副溶血弧菌某些关键致病基因，科学家对弧菌致病机理的认识仍然严重滞后于肠杆菌科的致病菌。缺乏成熟、便捷的遗传操作技术是弧菌分子致病机理研究的主要障碍。

基于细菌recBCD同源重组系统的基因敲除技术是目前在多种细菌中可以实现的技术。在这种技术中，目的基因的框内缺失融合片段首先通过交叠PCR扩增获得，PCR产物与自杀载体采用相同的酶酶切纯化后再连接，并转化大肠杆菌，获得带有外源片段的自杀质粒(载体)，该自杀质粒再经由供体菌接合输入到受体靶细菌中。该质粒由于自身的限制并不能在靶细菌中复制，在正向选择压力下(通常是质粒上的抗性基因)，只有基因组通过同源重组整合了自杀质粒的靶细菌才能存活下来，形成插入突变；在反向选择压力下，插入突变细胞发生第二次同源重组，整合态的自杀质粒脱离染色体，理论上形成一个野生型细胞和一个基因缺失突变细胞，从而实现靶基因的敲除。由此可见，自杀载体是基于细菌recBCD同源重组系统的基因敲除技术的核心。

目前基于细菌recBCD同源重组系统的基因敲除技术在弧菌中的应用还非常少见，仅有一些偶然成功的报道。可以成功用于大肠杆菌等细菌的同源重组的基因敲除技术在弧菌基因敲除中存在一些明显的缺陷，包括：(1)缺乏通用性，仅限于某一个弧菌中的基因缺失；(2)sacB被广泛用作自杀载体的致死基因，但sacB所引发的致死效应在弧菌中十分弱，导致反向选择平板中正确的缺失突变克隆出现的比例非常低，造成大量的缺失突变筛选工作；(3)需要对目的片段交叠PCR产物及自杀质粒进行双酶切，费时费力；(4)自杀质粒本身较大，且带有mobI移动基因，不仅造成质粒接合转移的效率低，而且有可能引起非特异性整合。(5)受体菌必须具有与供体菌及自杀载体不同的抗性标记，限制了常规技术的应用。因此，当用于弧菌基因敲除时，现有自杀载体表现出明显的局限性，迫切需要发展新的通用型自杀载体以克服上述缺陷，实现基于细菌recBCD同源重组系统的基因敲除技术在弧菌中的广泛应用。

发明内容：

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种弧菌通用的基因敲除自杀载体pLP12T。

本发明的基因敲除自杀载体pLP12，为环状载体，其特征在于，包括P_BAD启动子、阻遏蛋白基因araC、RP4转移起始位点(oriT_RP4)、氯霉素抗性基因(cat)、R6K复制起始位点(oriV_R6Kγ)、多克隆位点区(MCS)和致死基因vmi480，所述的多克隆位点区(MCS)至少包含两个AhdI酶切位点，所述的致死基因vmi480的核苷酸序列如SEQIDNO.1的第21-617位碱基序列所示，所述的致死基因vmi480位于P_BAD启动子下游并处于P_BAD启动子控制之下。

优选，所述的基因敲除自杀载体pLP12，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，含有3871bp的碱基。

本发明还提供了一种基因敲除自杀载体pLP12T，为线性载体，其特征在于，是将上述基因敲除自杀载体pLP12用AhdI酶切多克隆位点区中的两个AhdI酶切位点后得到的线性载体，即为基因敲除自杀载体pLP12T。

优选，所述的基因敲除自杀载体pLP12T，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示，含有3848bp的碱基。