[发明专利]一种从Cohn组分Ⅳ沉淀中分离纯化α2-巨球蛋白的方法

说明书

本发明公开了一种从Cohn组分Ⅳ沉淀中分离纯化α2‑巨球蛋白的方法，将Cohn组分Ⅳ沉淀依次经过硫酸铵盐析、锌离子亲和层析、凝胶过滤和超滤浓缩，最终得到α2‑巨球蛋白。本发明以工业废料Cohn组分Ⅳ沉淀为原料，结合盐析、亲和层析及凝胶过滤的方法纯化出了具有临床应用价值的血浆蛋白α2‑巨球蛋白，将Cohn组分Ⅳ沉淀变废为宝，综合利用了血浆。同时该方法操作简便，易于放大，适合规模化分离纯化α2‑巨球蛋白。

技术领域

本发明涉及血液制品分离纯化技术领域，特别是涉及一种从Cohn组分Ⅳ沉淀中分离纯化α2-巨球蛋白的方法。

背景技术

Cohn组分Ⅳ沉淀是血浆蛋白生产中的废弃物，也可简称为CohnⅣ沉淀。CohnⅣ沉淀中主要是蛋白，其中包括很多有潜在价值的蛋白质，但现在通常作为废弃物丢掉，这些蛋白无论作为临床使用还是作为生化诊断试剂都有着非常广阔的前景。比如α1-抗胰蛋白酶：可以治疗α1-抗胰蛋白酶先天性缺乏伴肺气肿患者，是美国FDA批准的药品；α2-巨球蛋白：用于放射损伤的治疗以及眼角膜损伤和角膜炎的治疗；补体1酯酶抑制剂：用于治疗遗传性血管神经性水肿；结合珠蛋白：静脉输注结合珠蛋白或用固相化结合珠蛋白体外循环去除血液中的游离血红蛋白，防止和治疗溶血性肾衰竭；运铁蛋白：治疗先天性无运铁蛋白血症，用脱铁的运铁蛋白治疗铁血黄素沉着症；铜蓝蛋白：促进红细胞生成，治疗贫血。

其中，α2-巨球蛋白(α2-M)是体内重要的蛋白酶抑制剂，分子量为720kD(千道尔顿)。它是由四个相同亚基组成的四聚体，每个亚基由1451个氨基酸组成，含糖量为8-11％。α2-M主要由肝细胞合成，在正常人血浆中的含量为2-4g/L。在人体内α2-M能够清除多余的内源性及外源性蛋白酶而发挥蛋白酶抑制剂的作用。除此之外α2-M还具有抗辐射、抗肿瘤、抑制氧自由基、参与凝血平衡及与调节细胞因子活性等作用。

α2-M曾收录在1990年版生物制品规程试行规程上，其临床适应症主要是针对放射性皮肤和粘膜局部溃疡、损伤，放疗部位手术创口崩裂、溃疡、组织坏死以及角膜炎等。但是目前国内外尚无α2-M相关产品上市。近年来随着世界核安全形势的紧张以及肿瘤患者放疗致皮肤黏膜损伤的普遍，研发α2-M相关产品无论从国家及军队战略储备角度考虑还是从日常临床需求考虑都显得十分必要。要想得到α2-M相关产品，首先要有纯度高的α2-M。

最早1955年Schultze从人血清中首次分离出α2-M，随着对α2-M生物学特性研究的深入及其临床应用的开展，对α2-M纯化制备工艺的研究也越加广泛。早在1975年SONG等人(M.K.SONG,et al,Large Scale Purification of α2-Macroglobulin from HumanPlasma,Biochemical Medicine,1975,14:162-169)报道通过利凡诺分级沉淀结合PEG沉淀、凝胶过滤的方法制备出了纯度较高的α2-M，该工艺的回收率达60％。国内学者刘文方等(刘文方等，利凡诺法分离人血浆α2-M的研究，中华血液学杂志1984,5(5)：323)同样使用利凡诺分级沉淀的方法制备出纯度80％以上的α2-M，但20世纪90年代中国禁止使用利凡诺法生产人血液制品，因此该工艺被废除。

1978年Virca等(G.D.Virca,et al,Purification of human α2-macrolobulinby chromatography on cibacron blue sepharose,Analytical Biochemistry,1978,89:274-278)使用cibacron蓝色染料亲和层析的方法制备α2-M，其活性回收率高达75％，但该方法的局限性在于起始纯化血浆中结合珠蛋白的类型需为1-1型，而1-1型结合珠蛋白献浆者只占总献浆者的10％，这限制了α2-M纯化制备时的原料来源。