[发明专利]酵母菌转化异丁香酚生产香兰素的方法

权利要求书

1.一种酵母菌转化异丁香酚生产香兰素的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、构建用于生产异丁香酚单加氧酶的酵母菌；

所述步骤S1包括以下步骤：

S1-1、提取土壤的全基因组DNA；所述土壤含有异丁香酚单加氧酶基因；

S1-2、根据异丁香酚单加氧酶的基因序列，设计简并PCR引物；

S1-3、以所述全基因组DNA为模板，用所述简并PCR引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

S1-4、将所述PCR扩增产物测序，以获得异丁香酚单加氧酶基因序列；

S1-5、根据所述异丁香酚单加氧酶基因序列，设计包含酶切位点的特异性引物，所述特异性引物包括上游引物SEQ ID NO.1和下游引物SEQ ID NO.2；

S1-6、以所述全基因组DNA为模板，用所述特异性引物进行PCR扩增，得到大小为1438bp的目标基因SEQ ID NO.3，其5’和3’端分别连接6bp和8bp的酶切位点；

S1-7、将所述目标基因SEQ ID NO.3插入毕赤酵母表达载体pPIC9K的EcoRI和NotI酶切位点之间，得到重组质粒pPIC9K-IEM；

S1-8、将所述重组质粒pPIC9K-IEM转化毕赤酵母GS115，得到所述酵母菌；

S2、将构建的所述酵母菌接种至YPD液体培养基中，于30℃振荡培养36小时；

S3、离心收集菌体，生理盐水洗涤，转入MGY液体培养基中；于30℃振荡培养36小时；

S4、离心收集菌体，生理盐水洗涤，转入MM液体培养基中使OD600>6，于30℃振荡培养3天；每天补加甲醇10g/L，并用氨水调节pH至5-7，得到发酵液；选择性地将所述发酵液离心以收集上清液；

S5、按异丁香酚：发酵液或上清液：缓冲液＝0.1-0.6g：9-18mL：9-18mL加入反应容器中，在20-30℃下振摇转化12-48h，得到香兰素；所述缓冲液为pH8-10.4的甘氨酸的NaOH水溶液；

所述步骤S5中，在所述反应容器中，还添加DMSO、离子液体及香兰素吸附剂中的至少一种；

每0.1-0.6g异丁香酚中：所述DMSO的加入量≤1mL，所述离子液体的加入量≤200μL，所述香兰素吸附剂的加入量≤0.5g；所述香兰素吸附剂为吸附树脂及壳聚糖膜中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的酵母菌转化异丁香酚生产香兰素的方法，其特征在于，所述步骤S1-5中：

SEQ ID NO.1的序列如下：5’-gaattcatgctacatatggcaacgtttgaccgcaat-3’

SEQ ID NO.2的序列如下：5’-gcggccgccttatctctcgaggttcttagactgccaac-3’。

3.根据权利要求1所述的酵母菌转化异丁香酚生产香兰素的方法，其特征在于，所述步骤S5中，所述甘氨酸的NaOH水溶液中甘氨酸的浓度为50-200mM。

4.根据权利要求1所述的酵母菌转化异丁香酚生产香兰素的方法，其特征在于，所述步骤S3中，所述菌体采用生理盐水洗涤2次；

所述步骤S4中，所述菌体采用生理盐水洗涤2次。

5.根据权利要求1所述的酵母菌转化异丁香酚生产香兰素的方法，其特征在于，所述步骤S2中，以180-220r/min振荡培养；

所述步骤S3中，以180-220r/min振荡培养；

所述步骤S4中，以180-220r/min振荡培养。

6.根据权利要求1所述的酵母菌转化异丁香酚生产香兰素的方法，其特征在于，所述步骤S4中，补加甲醇5-20g/L，采用纯氨水调节pH至5-7。

7.根据权利要求1所述的酵母菌转化异丁香酚生产香兰素的方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述YPD液体培养基包括组分及其质量百分比如下：1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖，其余为水；

所述步骤S3中，所述MGY液体培养基包括组分及其质量百分比如下：1.34％YNB、1％甘油、4×10^–5％生物素，其余为水；

所述步骤S4中，所述MM液体培养基包括组分及其质量百分比如下：1.34％YNB、4×10^–5％生物素、0.5％甲醇，其余为水。