[发明专利]酵母菌转化异丁香酚生产香兰素的方法

说明书

本发明公开了一种酵母菌转化异丁香酚生产香兰素的方法，包括：S1、构建用于生产异丁香酚单加氧酶的酵母菌；S2、将构建的所述酵母菌接种至YPD液体培养基中振荡培养；S3、离心收集菌体，生理盐水洗涤，转入MGY液体培养基中振荡培养；S4、离心收集菌体，生理盐水洗涤，转入MM液体培养基中使OD600>6，振荡培养3‑5天；每天补加甲醇，并用氨水调节pH，得到发酵液；选择性地将所述发酵液离心以收集上清液；S5、按异丁香酚：所述上清液或所述发酵液：缓冲液＝0.1‑0.6g：9‑18mL：9‑18mL加入反应容器中，在20‑30℃下振摇转化12‑48h，得到香兰素。本发明实现采用酵母菌工业化生产香兰素，适用于食品领域等，满足需求，安全。

技术领域

本发明涉及生物转化技术领域，尤其涉及一种酵母菌转化异丁香酚生产香兰素的方法。

背景技术

香兰素是工业中应用最广泛的香料之一，大量用于食品工业，可作为香气修饰和定香的主要原料用于食品、牙膏、香皂、烟草中；在医药化工中作为重要的原料或中间体，可用于制造治疗高血压、心脏病、皮肤病及消除口臭、利尿的常用药物；在化学工业中可作为化学助剂，用于塑料制品的抗硬化剂以及Ni、Cr、Cd等金属的电镀光亮剂；在农业生产上，香兰素可作为作物增产剂和催熟剂，并用之制备除草剂和昆虫引诱剂等，需求量很大。香兰素目前主要由化学方法制备，但用化学合成法制得的香兰素不是天然香料。天然香兰素可以从香子兰的花荚中提取，但用植物组织提取的方法生产的天然香兰素量少而价高，不能满足日益增长的需求。

随着世界各国对食品安全越来越重视，对天然香兰素的需求越来越大。天然香料是指由动植物材料经物理(包括蒸馏、溶剂萃取)方法、酶法或微生物方法得到的，可通过传统的食品加工方法(包括干燥、焙烤、发酵)加工后用于人类消费的物质。根据欧洲和美国立法，利用动植物资源通过物理方法、酶法或微生物法得到的物质才能称为天然物质(MuheimAndrea.US6,235,507.2001)。用生物法生产的香兰素，属天然产品，可以生物降解，符合消费者追求天然产品的消费心理。因此，利用生物转化技术生产生物香兰素，是一种有效的、很有前途的替代方法。

在过去的十年里报道了许多用微生物法或酶法生产香兰素的方法，一般都是通过微生物或酶将合适的前体转化为香兰素。目前，尚未有酵母菌转化异丁香酚生产香兰素的任何公开及报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，针对现有相关的上述缺陷，提供一种实现采用酵母菌工业化生产香兰素的酵母菌转化异丁香酚生产香兰素的方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种酵母菌转化异丁香酚生产香兰素的方法，包括以下步骤：

S1、构建用于生产异丁香酚单加氧酶的酵母菌；

S2、将构建的所述酵母菌接种至YPD液体培养基中，于30-35℃振荡培养18-36小时；

S3、离心收集菌体，生理盐水洗涤，转入MGY液体培养基中；于30-35℃振荡培养36-60小时；

S4、离心收集菌体，生理盐水洗涤，转入MM液体培养基中使OD600>6，于30-35℃振荡培养3-5天；每天补加甲醇，并用氨水调节pH，得到发酵液；选择性地将所述发酵液离心以收集上清液；

S5、按异丁香酚：发酵液或上清液：缓冲液＝0.1-0.6g：9-18mL：9-18mL加入反应容器中，在20-30℃下振摇转化12-48h，得到香兰素；所述缓冲液为pH8-10.4的甘氨酸的NaOH水溶液(简称甘氨酸/NaOH缓冲液)。

优选地，所述步骤S1包括以下步骤：

S1-1、提取土壤的全基因组DNA；

S1-2、根据异丁香酚单加氧酶的基因序列，设计简并PCR引物；