[发明专利]胆汁螺杆菌的实时荧光定量PCR检测方法

说明书

技术领域

本发明属于病原菌检测领域，具体涉及一种胆汁螺杆菌的实时荧光定量PCR检测方法。

背景技术

胆汁螺杆菌(Helicobacterbilis)属于螺杆菌属细菌，为革兰氏阴性菌，生长要求苛刻，主要寄生于消化道，是一种典型而重要的螺杆菌，常以隐性感染形式普遍存在于大鼠、小鼠、沙鼠等啮齿动物的消化道中，与啮齿动物肝胆疾病、盲肠炎、结肠炎等的发生高度相关。研究指出，胆汁螺杆菌还与人类胆管癌、胆囊炎等肠道疾病的发生存在相关性，对人类具有潜在危害性。模型动物感染螺杆菌时，可诱发一些并发疾病，严重影响实验动物质量并对实验数据的可靠性产生潜在的干扰。因此，螺杆菌在实验动物中的感染已经引起国内外研究者的高度重视，欧洲实验动物联盟已将其列为实验动物必须排除的病原菌，但我国因缺乏有效的检测方法，而尚未被列入实验动物质量国家标准，造成我国实验动物科研领域与国际水平的差距，进一步影响我国实验动物产业化，并对实验动物进出口带来不利影响。

目前，胆汁螺杆菌感染的检测方法主要有病原学、血清学及分子生物学方法：

（1）细菌分离培养：取粪便沉淀或肠壁粘液，在特殊的培养基和微氧环境下培养分离该菌。因胆汁螺杆菌的生长条件苛刻，分离培养的成功率较低，且该菌生长缓慢，需要培养5～7d，生化鉴定试验操作繁琐，耗时费力，检测周期较长，而阻碍了该检测方法的应用。

（2）血清学检测：运用ELISA方法来检测血清或粪便中胆汁螺杆菌的特异性抗体。免疫学方法操作简便，可在同一时间内检测大量样品，但由于螺杆菌属细菌繁多，并且互相之间存在交叉反应，故难以对胆汁螺杆菌进行定性检测。

（3）PCR检测：随着分子生物学技术的发展，PCR检测技术因高效、快速简便等优点而被广泛应用于检测螺杆菌。目前，所报道的PCR检测方法主要包括普通PCR、多重PCR、巢氏PCR等。常规PCR检测技术操作较为繁琐，需对扩增后产物进行电泳分析，而在后处理过程中不同样品间容易发生交叉污染，容易造成检测结果的假阳性；此外，常规PCR只能对细菌进行定性检测，无法定量检测；所以影响了常规PCR检测方法在病原微生物的检测方面的大规模应用。

发明内容

本发明目的在于提供一种胆汁螺杆菌的实时荧光定量PCR检测方法及其引物和探针，以解决上述检测方法操作繁琐、费时费力、成功率低等问题。

本发明所采取的技术方案是：

一种胆汁螺杆菌实时荧光定量PCR检测方法的引物，其核苷酸序列如下所示：

引物F：TACCACTGGAATGTAAAAGGCA（SEQIDNO：1）；

引物R：CTTCTTTTAGCGTTACATACGGAGT（SEQIDNO：2）。

一种胆汁螺杆菌实时荧光定量PCR检测方法的探针，其核苷酸序列如下所示：

探针P：CCACAAGTCCATGCGGCAACAGAAG（SEQIDNO：3）。

优选的，所述探针5’端添加了荧光报告基团FAM序列，3’端添加了荧光淬灭基团BHQ序列。

一种胆汁螺杆菌的实时荧光定量PCR检测方法，包括下列步骤：

提取待测样品DNA作为模板，利用上述的引物和探针进行实时荧光定量PCR检测，鉴定样品中是否含有胆汁螺杆菌。

一种胆汁螺杆菌的实时荧光定量PCR检测方法，包括下列步骤：

1)构建包含胆汁螺杆菌保守基因序列的质粒作为阳性标准品，制作标准曲线；

2)提取待测样品DNA作为模板，与所述标准曲线以相同条件，利用上述的引物和探针进行实时荧光定量PCR检测，根据样品Ct值与标准曲线做比对进行定量分析。

优选的，所述实时荧光定量PCR检测采用的PCR反应体系为：

PremixExTaq（ProbeqPCR）（2×）10μL

10μM引物F0.5μL

10μM引物R0.5μL

5μM探针P0.8μL

RoxReferenceDyeII（50×）0.2μL

模板2μL

ddH₂O6μL

总体积20μL。

优选的，所述实时荧光定量PCR检测扩增程序为：第一阶段预变性，95℃30s，重复1个循环；第二阶段PCR反应，95℃5s，60℃34s，重复40个循环。

本发明的有益效果是：