[发明专利]一种合浦珠母贝肉抗氧化肽的串联表达载体和工程菌株的构建方法

权利要求书

1.一种合浦珠母贝肉抗氧化肽的串联表达载体和工程菌株的构建方法，其特征是包括以下步骤：

(1)选取合浦珠母贝肉抗氧化肽PFMAP，根据其氨基酸序列并按照毕赤酵母偏好密码子设计出其对应的核苷酸序列，并进一步构建其核苷酸全长序列，根据全长序列，合成对应的两条单链，将两条单链进行PCR变性反应，获得合浦珠母贝肉抗氧化肽PFMAP目的基因，将PFMAP目的基因经限制性内切酶XhoⅠ和SalⅠ双酶切，与同样经XhoⅠ和SalⅠ双酶切的pBluescriptⅡKS质粒相连接，得重组载体，然后将重组载体经热激转化至DH5α感受态细胞，制得单倍体重组载体pBluescriptⅡKS-PFMAP；

(2)以单倍体重组载体pBluescriptⅡKS-PFMAP为模板，加入上下游通用引物M13⁺、M13-进行PCR特异性扩增，得到的PCR产物经电泳检测为单倍体目的条带基因pBluescriptⅡKS-PFMAP，将目的条带基因pBluescriptⅡKS-PFMAP经限制性内切酶QuickXbaⅠ和QuickKpnⅠ双酶切后的基因，与同样经QuickXbaⅠ和QuickKpnⅠ双酶切的pPICZαA质粒的基因相连接，制得合浦珠母贝肉抗氧化肽的串联表达载体pPICZαA-pBluescriptⅡKS-PFMAP；

(3)制备毕赤酵母菌GS115感受态细胞，将GS115感受态细胞与用限制性内切酶SacI单酶切线性化后的串联表达载体pPICZαA-pBluescriptⅡKS-PFMAP进行电转化和诱导培养，即制备得毕赤酵母工程菌株GS115-pPICZαA-pBluescriptⅡKS-PFMAP。

2.根据权利要求1所述的合浦珠母贝肉抗氧化肽的串联表达载体和工程菌株的构建方法，其特征是：步骤(1)中构建其核苷酸全长序列的过程是：选取合浦珠母贝肉抗氧化肽，在抗氧化肽的两端加入内切酶XhoI和SalI，并在两端分别加上3～5个保护碱基，且在内切酶和合浦珠母贝肉抗氧化肽基因之间加上溴化氰和羟胺所识别的蛋白切割位点，构建合浦珠母贝肉抗氧化肽的核苷酸全长序列。

3.根据权利要求1所述的合浦珠母贝肉抗氧化肽的串联表达载体和工程菌株的构建方法，其特征是：步骤(1)中PCR变性反应时的温度为92～96℃，变性时间为2～5min。

4.根据权利要求1所述的合浦珠母贝肉抗氧化肽的串联表达载体和工程菌株的构建方法，其特征是：步骤(1)中将单倍体重组载体pBluescriptⅡKS-PFMAP经XhoⅠ单酶切和去磷酸化处理后的基因，与PFMAP目的基因经XhoⅠ和SalⅠ双酶切后的基因相连接，获得2倍体重组载体pBluescriptⅡKS-2PPFMAP，同理，可获得4倍体重组载体pBluescriptⅡKS-4PFMAP、6倍体重组载体pBluescriptⅡKS-6PFMAP和12倍体重组载体pBluescriptⅡKS-12PFMAP。

5.根据权利要求4所述的合浦珠母贝肉抗氧化肽的串联表达载体和工程菌株的构建方法，其特征是：去磷酸化采用去磷酸化酶SAP；经XhoⅠ和SalⅠ双酶切和去磷酸化处理后的PFMAP目的基因与经XhoⅠ单酶切和去磷酸化处理后的单倍体重组载体pBluescriptⅡKS-1PFWM的基因的摩尔比为3～10:1。

6.根据权利要求4所述的合浦珠母贝肉抗氧化肽的串联表达载体和工程菌株的构建方法，其特征是：步骤(2)中还能以2倍体重组载体pBluescriptⅡKS-2PFMAP、4倍体重组载体pBluescriptⅡKS-4PFMAP、6倍体重组载体pBluescriptⅡKS-6PFWM或12倍体重组载体pBluescriptⅡKS-12PFMAP为模板，制得合浦珠母贝肉抗氧化肽的串联表达载体pPICZαA-pBluescriptⅡKS-2PFMAP、pPICZαA-pBluescriptⅡKS-4PFMAP、pPICZαA-pBluescriptⅡKS-6PFMAP或pPICZαA-pBluescriptⅡKS-12PFMAP。