[发明专利]一种合浦珠母贝肉抗氧化肽的串联表达载体和工程菌株的构建方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种合浦珠母贝肉抗氧化肽的串联表达载体和工程菌株的构建方法。

背景技术

合浦珠母贝又称马氏珠母贝，属软体动物门双壳纲珍珠贝目珍珠贝科，是海水养殖珍珠贝主要品种，生产“南珠”的母贝。它主要分布在广西、广东和台湾海峡南部沿海一带，是我国养殖面积最广、数量最大的人工养殖海水珍珠贝类之一。合浦珠母贝肉是一种高蛋白、低脂肪、低糖、营养价值高的优质蛋白来源的海产品，其粗蛋白干重含量在66.71％～81.2％之间，具有较高的开发利用价值。中国水产科学研究院南海水产研究所近几年来一直致力于合浦珠母贝肉的开发利用，通过对珠母贝肉进行定向酶解，得到小分子抗氧化活性肽，经质谱结构解析得到相对应的氨基酸序列Gly-Ala-Gly-Leu-Pro-Gly-Lys-Arg-Glu-Arg；与之对应的氨基酸序列简写为GAGLPGKRER(具体参阅申请号为201410040473.4的发明专利中所述)；该肽抗氧化活性强，且较稳定，为了将这个抗氧化肽大量生产应用，如果只是采用酶解珍珠贝肉的方法，由于酶解过程副反应较多，含有多种其他肽类和小分子物质，纯化成本较高，产量又低。因此，急需寻找一种专一性强、成本低的方法来生产这种序列的合浦珠母贝肉抗氧化肽(PFMAP，Pinctadafucatameatantioxidantpeptides)。

基因重组技术是当前世界比较流行的方法，是大量制备多肽的研究热点之一，现有技术中存在以下三种体外基因串联的方法：一是随机定向串联法，该种方法串联结果是不定向的，是随机的，这在表达翻译过程中可能导致产生错误的蛋白；二是化学拼接法，这个方法对于构建多拷贝的(4倍以上)就不太适合，原因是人工合成序列成本高；三是PCR扩增串联法，这个与化学拼接法类似，也是随着拷贝数增加，合成成本增加。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种合浦珠母贝肉抗氧化肽的串联表达载体和工程菌株的构建方法，该方法通过构建合浦珠母贝肉抗氧化肽的串联表达载体和工程菌株来获取合浦珠母贝肉抗氧化肽，专一性强，成本低。

本发明所要解决的上述技术问题是通过以下技术方案来实现的：一种合浦珠母贝肉抗氧化肽的串联表达载体和工程菌株的构建方法，包括以下步骤：

(1)选取合浦珠母贝肉抗氧化肽PFMAP，根据其氨基酸序列并按照毕赤酵母偏好密码子设计出其对应的核苷酸序列，并进一步构建其核苷酸全长序列，根据全长序列，合成对应的两条单链，将两条单链进行PCR变性反应，获得合浦珠母贝肉抗氧化肽PFMAP目的基因，将PFMAP目的基因经限制性内切酶XhoⅠ和SalⅠ双酶切，与同样经XhoⅠ和SalⅠ双酶切的pBluescriptⅡKS质粒相连接，得重组载体，然后将重组载体经热激转化至DH5α感受态细胞，制得单倍体重组载体pBluescriptⅡKS-PFMAP；

(2)以单倍体重组载体pBluescriptⅡKS-PFMAP为模板，加入上下游通用引物M13⁺、M13-进行PCR特异性扩增，得到的PCR产物经电泳检测为单倍体目的条带基因pBluescriptⅡKS-PFMAP，将目的条带基因pBluescriptⅡKS-PFMAP经限制性内切酶QuickXbaⅠ和QuickKpnⅠ双酶切后的基因，与同样经QuickXbaⅠ和QuickKpnⅠ双酶切的pPICZαA质粒的基因相连接，制得合浦珠母贝肉抗氧化肽的串联表达载体pPICZαA-pBluescriptⅡKS-PFMAP；

(3)制备毕赤酵母菌GS115感受态细胞，将GS115感受态细胞与用限制性内切酶SacI单酶切线性化后的串联表达载体pPICZαA-pBluescriptⅡKS-PFMAP进行电转化和诱导培养，即制备得毕赤酵母工程菌株GS115-pPICZαA-pBluescriptⅡKS-PFMAP。

在上述合浦珠母贝肉抗氧化肽的串联表达载体和工程菌株的构建方法中：

步骤(1)中构建其核苷酸全长序列的过程是：选取合浦珠母贝肉抗氧化肽，在抗氧化肽的两端加入内切酶XhoI和SalI，并在两端分别加上3～5个保护碱基，且在内切酶和合浦珠母贝肉抗氧化肽基因之间加上溴化氰和羟胺所识别的蛋白切割位点，构建得合浦珠母贝肉抗氧化肽的核苷酸全长序列。

步骤(1)中PCR变性反应时的温度为92～96℃，变性时间为2～5min。