[发明专利]一种昆虫DNA拓扑异构酶I突变体及其应用

权利要求书

1.一种昆虫DNA拓扑异构酶I突变体，其特征在于，参照人类拓扑异构酶I的氨基酸全长序列进行编号，昆虫DNA拓扑异构酶I的653位氨基酸为苏氨酸。

2.根据权利要求1所述一种昆虫DNA拓扑异构酶I突变体，其特征在于，所述昆虫DNA拓扑异构酶I突变体为甜菜夜蛾DNA拓扑异构酶I突变体，甜菜夜蛾DNA拓扑异构酶I的氨基酸全长序列的GenBankID为JN258956，参照人类拓扑异构酶I的氨基酸全长序列进行编号，所述甜菜夜蛾DNA拓扑异构酶I突变体中的653位氨基酸由丙氨酸突变为苏氨酸。

3.根据权利要求2所述一种昆虫DNA拓扑异构酶I突变体，其特征在于，所述甜菜夜蛾DNA拓扑异构酶I突变体包含SEQIDNO:1所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求3所述一种昆虫DNA拓扑异构酶I突变体，其特征在于，所述编码甜菜夜蛾DNA拓扑异构酶I突变体的核苷酸序列包含SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。

5.权利要求1至4任一项所述的昆虫DNA拓扑异构酶I突变体在农药筛选中的应用。

6.权利要求1至4任一项所述的昆虫DNA拓扑异构酶I突变体在喜树碱类农药筛选中的应用。

7.一种利用昆虫DNA拓扑异构酶I突变体筛选农药的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)配制阴性对照组的反应体系：二甲基亚砜体积分数为5％，昆虫DNA拓扑异构酶I突变体的纯化蛋白的质量为50ng，2.0μL10×TopI反应缓冲液，1.0μL浓度为0.5μg/μLpBR322DNA，水补足至20μL，将各组分混匀；10×TopI反应缓冲液的组份为：1.5MKCl，100mMTris-HCl，10mM二硫苏糖醇，10mMEDTA，1mg/mL牛血清白蛋白，pH7.5；

2)配制空白对照组的反应体系：添加2.0μL10×TopI反应缓冲液，1.0μL浓度为0.5μg/μLpBR322DNA，水补足至20μL，将各组分混匀；10×TopI反应缓冲液的组份同步骤1)；

3)配制实验组的反应体系：添加昆虫DNA拓扑异构酶I突变体纯化蛋白50ng，2.0μL10×TopI反应缓冲液，1.0μL浓度为0.5μg/μLpBR322DNA，1.0μL待筛选的农药，水补足至20μL，将各组分混匀；所述实验组设有多组，分别添加不同浓度的待筛选农药；10×TopI反应缓冲液的组份同步骤1)；

4)将各反应体系置于27℃，反应30min，测定酶活性单位数；

5)终止反应：反应结束后，向体系内加入1μL250μg/mL蛋白酶K和2μL5％SDS，37℃，终止反应30min；

6)反应液离心后，取上清液与Loadingbuffer混匀后，上样于琼脂糖凝胶中，进行电泳；

7)染色：用25μM溴化乙锭溶液染色10min，用水润洗凝胶，去除凝胶上溴化乙锭残留液，紫外凝胶成像系统对电泳结果进行图像采集；

8)采用QuantityOne软件对电泳图片的各泳道进行识别和去背景操作后，通过对泳道内的超螺旋条带的光密度值进行扫描，按照超螺旋光密度百分率％＝实验组超螺旋光密度/空白对照组超螺旋光密度×100％，计算体系内的超螺旋百分数。

8.根据权利要求7所述一种利用昆虫DNA拓扑异构酶I突变体筛选农药的方法，其特征在于，所述添加的待筛选的农药的浓度为0.01-100μM。

9.根据权利要求7所述一种利用昆虫DNA拓扑异构酶I突变体筛选农药的方法，其特征在于，所述昆虫DNA拓扑异构酶I突变体为权利要求2所述的甜菜夜蛾DNA拓扑异构酶I突变体。

10.一种利用昆虫DNA拓扑异构酶I突变体筛选农药的试剂盒，其特征在于，包括：10×TopI反应缓冲液，浓度为0.5μg/μLpBR322DNA，昆虫DNA拓扑异构酶I突变体、水、二甲基亚砜；所述10×TopI反应缓冲液的组份为：1.5MKCl，100mMTris-HCl，10mM二硫苏糖醇，10mMEDTA，1mg/mL牛血清白蛋白，pH7.5。