[发明专利]一种昆虫DNA拓扑异构酶I突变体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种昆虫DNA拓扑异构酶I突变体及其应用。

背景技术

喜树碱(Camptothecin，CPT)是一类五元环状生物碱，在喜树(Camptothecaacuminate)的各个器官中均有分布，该化合物靶标特异性强，对肿瘤细胞具有较理想地抑制作用，在害虫防治方面同样有突出表现，其结构如式1所示。

式1喜树碱化学结构

Hsiang等(1985)发现CPT能特异性抑制哺乳动物TopI的催化活性，对细胞产生抑制作用，证实了CPT作用靶标为TopI。CPT主要与TopI-DNA二元复合物发生可逆性结合，导致DNA解旋反应终止，TopI-DNA-CPT三元复合物积累，阻止TopI对断裂DNA的再连接作用，影响DNA切口修复，使DNA处于断裂状态。而细胞在复制过程中，一旦复制叉与TopI-DNA-CPT三元复合物相撞，造成DNA复制过程停滞，将产生不可修复性损伤，最终引发细胞凋亡(LorenceAetal.,2004)。鉴于不同类型细胞内信号传递存在差异性，因此对于CPT与TopI-DNA二元复合物结合后引发的DNA损伤信号的转导路径及后续引发的反应也会发生相应的改变。自DeMilo和Borkovec(1974)发现CPT能诱发家蝇和毛虫不育依赖，人们相继发现CPT在害虫防治方面均具有良好的效果。

CPT较为理想的害虫防治效果取决于植物长期自然选择的结果。为了克服环境压力和预防天敌，植物在进化过程中会产生各种对自身生长非必须的次级代谢产物，而这些产物在趋避害虫方面具有一定的作用。喜树类植物如喜树(Camptothecaacuminata)、白花蛇根草(Ophirrhizapumila)和小花蛇根草(Ophiorrihizaliukiuensis)(SirikantaramasSetal.,2008)，在长期的进化过程中逐渐形成了对自身生长无害但对昆虫有毒的喜树碱类物质。通过对CPT在害虫防治及作用机理方面的深入研究，发现CPT在害虫防治方面确实具有较理想的效果，但是对于其是否具备成为一种高效、低毒、环境相容性好的植物源农药，仍需要进行深入研究，并通过优化其结构使之成为未来绿色农业发展中高效低风险农用投入品。

DNA拓扑异构酶广泛存在于生物体内，控制和调节DNA拓扑状态。主要通过磷酸酪氨酸与DNA连接，使DNA双链发生暂时或者局部解旋作用，解开DNA超螺旋结构，释放由DNA解旋所产生的扭转张力问题，调节DNA拓扑结构，促进DNA高效率运转。在DNA转录，复制和重组过程中发挥重要作用(ChillemiGetal.,2004；LosassoCetal.,2007)。DNA拓扑异构酶I(TopoisomeraseI,TopI)，是迄今为止发现的首个拓扑异构酶。随后，又发现了不同物种均存在TopI)。

TopI突变及抑制表达可以作为体外获取CPT及其类似物抗性的主要途径。但现在已经发现的TopI的突变数量以及种类有限，限制了CPT及其类似物的广泛筛选。

发明内容

鉴于现有技术所存在的问题，本发明提供一种昆虫DNA拓扑异构酶I突变体，通过利用昆虫DNA拓扑异构酶I突变体构建筛选平台，对来自动物、植物及微生物的化合物进行活性筛选，可以发现更多的可被防治农业害虫利用的DNA拓扑异构酶I抑制剂，筛选出更多昆虫DNA拓扑异构酶I抑制剂先导化合物，为新农药的创制提供更具发展潜力的先导化合物。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种昆虫DNA拓扑异构酶I突变体，参照人类拓扑异构酶I的氨基酸全长序列进行编号，昆虫DNA拓扑异构酶I突变体的653位氨基酸为苏氨酸。

因为在研究昆虫DNA拓扑异构酶I时，本领域技术人员习惯参照人类TopI的氨基酸序列中的氨基酸的位置进行描述。人类拓扑异构酶I即人类(HM)TopI。人类(HM)TopI的氨基酸全长序列的GenBankID为J03250，如SEQIDNO:7所示。将人类(HM)TopI的氨基酸全长序列与昆虫DNA拓扑异构酶I的氨基酸全序列进行比对，当昆虫DNA拓扑异构酶I的氨基酸全序列中的氨基酸与人类(HM)TopI的氨基酸全长序列中的氨基酸能够比对上时，给予编号，从而可以参照人类(HM)TopI的氨基酸全长序列定义出本发明所述的昆虫DNA拓扑异构酶I突变体的653位氨基酸。

本发明所述的“突变体”表示一种与野生型氨基酸序列不同的酶。