[发明专利]一种用于细胞内糖链抗原活检的双光子荧光探针、荧标试剂盒以及检测方法

权利要求书

1.一种用于细胞内糖链抗原活检的双光子荧光探针制备成的荧标试剂盒，其特征在于，其由双光子荧光标记探针LP、抗糖链抗原单克隆抗体-Ab、硝酸纤维素膜、抗糖链抗原单克隆抗体-IgG、阳性对照品、阴性对照品、封闭缓冲液和洗涤缓冲液组成；其中，所述的封闭缓冲液是pH为7.4，摩尔浓度为20mmol/L的PBS，并且，其中含有质量百分比为0.5％的BSA；所述的洗涤缓冲液是pH为7.4，摩尔浓度为50mmol/L的PBS，并且，其中含有质量百分比为0.05％的吐温20；

双光子荧光标记探针LP，结构式为：

该荧标试剂盒用于细胞内糖链抗原活检的方法，包括以下步骤：

(1)包被：在硝酸纤维素膜上滴加2～6μL抗糖链抗原单克隆抗体-Ab，一滴一点，各点间相隔1-2cm，并滴加完成后，置于温度为4℃环境中，吸附0.5-1h；

(2)封闭：将步骤(1)包被完成的硝酸纤维素膜浸入封闭缓冲液中，在37℃下温育0.5-2h；

(3)一次洗涤：将步骤(2)封闭完成的硝酸纤维素膜采用洗涤缓冲液清洗至少三次，静置干燥；

(4)点样：向步骤(3)一次洗涤完成的硝酸纤维素膜按照步骤(1)滴加2～6μL抗糖链抗原单克隆抗体-Ab形成的点滴加阳性样品、阴性样品和待测样品，其中阳性样品、阴性样品和待测样品滴加的点的个数相等，每点滴加2-6uL；

(5)二次洗涤：待步骤(4)滴加的样品液完全渗入硝酸纤维素膜后，室温静置10-30min，采用洗涤缓冲液清洗膜片至少三次，静置干燥；

(6)荧光标记示踪：向步骤(5)处理完成的膜片上加入双光子荧光标记抗体LP-IgG，加入量为每点滴加2-6uL，在37℃下温育处理0.5-2h；

(7)三次洗涤：将步骤(6)处理好的膜片采用洗涤缓冲液清洗至少三次，取出膜片，去除表面残余液体；

(8)检测：将硝酸纤维素膜平铺在玻璃片上，在双光子荧光显微镜下检测。

2.如权利要求1所述的用于细胞内糖链抗原活检的双光子荧光探针制备成的荧标试剂盒，其特征在于，所述的阳性样品为纯化的糖链抗原Ag，其浓度为0.1-100ug/mL；所述的阴性样品为封闭缓冲液。

3.如权利要求1所述的用于细胞内糖链抗原活检的双光子荧光探针制备成的荧标试剂盒，其特征在于，所述的双光子荧光标记抗体LP-IgG，其制备方法是将摩尔质量为(1.9-2.1)×10^-5mmol的抗糖链抗原单克隆抗体-IgG溶于0.5mL的二甲基亚砜中，并采用摩尔浓度为0.1mol/L的溶液将pH调至9，将1.1×10^-5mmol的双光子荧光标记探针LP加入，搅拌反应24h，得到反应混合液，加入4倍体积的乙醚稀释反应混合液，析出沉淀，过滤，得固体；再向固体中加入二甲基亚砜至固体刚好溶解为止，得溶解液；并向溶解液中再次加入乙醚至不再有沉淀析出，过滤，干燥，得黄色固体，即为双光子荧光标记抗体LP-IgG。

4.如权利要求1所述的用于细胞内糖链抗原活检的双光子荧光探针制备成的荧标试剂盒，其特征在于，所述的去除表面残余液体是采用吸水纸吸干表面残余液体。

5.如权利要求1或3所述的用于细胞内糖链抗原活检的双光子荧光探针制备成的荧标试剂盒，其特征在于，所述的抗糖链抗原单克隆抗体-IgG，其制备方法是取4mL抗血清，并向其中加入pH值为4.0，摩尔浓度为0.06mol/L的醋酸缓冲液8mL，并采用氢氧化钠调整pH至4.8，在振荡条件下，加入120uL的正辛酸，在室温下振荡混合30min，在4℃下，10000rpm离心15min，去沉淀，并将上清液装入透析袋中，在0.01mol，pH值为7.4的PBS缓冲液中，透析12h，再加入等体积的饱和硫酸铵溶液，在4℃静置30min，再在12000rpm离心20min，取沉淀，得到抗糖链抗原单克隆抗体-IgG。

6.如权利要求5所述的用于细胞内糖链抗原活检的双光子荧光探针制备成的荧标试剂盒，其特征在于，所述的抗血清是经抗糖链抗原单克隆抗体-Ab三次免疫兔48天后，对其血液进行沉淀分离得到的血清。