[发明专利]一种用于细胞内糖链抗原活检的双光子荧光探针、荧标试剂盒以及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞内糖链抗原活检技术领域，尤其是一种用于细胞内糖链抗原活检的双光子荧光探针、荧标试剂盒以及检测方法。

背景技术

糖链抗原(Carbohydrate antigen 19-9，CA19-9)是一种与胰腺癌、胆囊癌、结肠癌和胃癌相关的肿瘤标识物，其单克隆抗体为1116NS19-9，简称Ab19-9；糖链抗原(Carbohydrate antigen 125，CA125)是一种与卵巢癌、输卵管腺癌、子宫内膜癌和宫颈癌相关的肿瘤标识物，其单克隆抗体为OC125，简称Ab125。CA19-9测定广泛用于结肠直肠癌胃癌、胰癌、肝细胞癌肺癌、乳癌的临床监测与诊断；而CA125测定则广泛用于卵巢癌、输卵管腺癌、子宫内膜癌、宫颈癌和乳腺癌的临床监测与诊断。

因此，对于检测体内糖链抗原需要一种快速、专一、可靠的检测方法，并且这种快速、专一、可靠的检测方法也是早期肿瘤或癌症的诊断和预警的有效途径之一。现有技术中，对于糖链抗原的检测，其采用的方法较多，但由于这些方法的灵敏度和稳定性较差，并且在进行检测操作时较为繁琐，检测的试样仅限于血液与外周血，进而逐步在糖链抗原检测领域受到了局限性，造成早期肿瘤或癌症的诊断和预警的结果不理想。

免疫荧光法，其特异性强、灵敏度高、速度快，与放射免疫法相比，无放射污染，操作简便；由于单光子荧光激发波长一般在350～560nm,易产生光致毒与光漂白；因此，在免疫荧光法中得到较大程度应 用的是双光子荧光。但是，将双光子荧光应用于肿瘤或者癌症标志物的糖链抗原的活检，还未见有任何文献报道。

发明内容

为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种用于细胞内糖链抗原活检的双光子荧光探针、荧标试剂盒以及检测方法。

双光子荧光采用800～1100nm的高强度激光作为激发光源,不仅能克服单光子荧光的缺点,还能实现深层暗场成像与定点激发,避免组织自发荧光干扰以及降低组织吸光系数,从而显著地提高成像的清晰度、检测的灵敏度与分辨率。

本发明以[Morales AR,Yanez CO,Schafer-Hales KJ,Marcus AI,Belfield KD.Biomolecule labeling and imaging with a new fluorenyl two-photon fluorescent probe.Bioconjugate Chem.,2009,20:1992–2000]为参考文献，将该文献中制备的双光子荧光探针LP标记抗-糖链抗原单克隆抗体-IgG，并将其借助免疫特异性亲合识别原理与双光子诱导荧光机制实现肿瘤标志物糖链抗原的实时动态活检。

其中双光子荧光探针LP的合成步骤以及合成过程是按照上述的参考文献进行合成，其中的反应的分子结构式为：

其中得出的双光子荧光探针LP为黄色固体物质(m.p.217～218℃)。1HNMR(500MHz，CDCl3)δ:8.134(dd，6H，Ph-H)，7.933(d，2H，Ph-H)，7.721(t，6H，4H，CH＝CH，and 4H，Ph-H)，7.615(s，2H，Ph-H)，7.584(d，2H，Ph-H)，7.521(t，2H，Ph-H)，7.413(t，2H，Ph-H)，7.335(m，4H，Ph-H)，3.232(m，7H，OCH2，CH3)，2.884(t，2H，OCH2)，2.765(s，4H，CH2)，2.581(m，4H，CH2)，1.953(m，2H，CH2)。13C NMR(125MHz，CDCl3)δ:170.545(C＝O)，167.416(Ar-C＝N)，157.103，154.175，149.362，140.854，140.513，137.075，135.014，132.236，131.352，128.264，127.853，127.317，123.425，122.971，121.773，71.852，69.921，58.764，55.735，52.606，48.344，34.236，26.224，25.382。元素分析(％，C55H45N3O6S2计算值)：C 72.71(72.74)，H 5.06(4.99)，N4.68(4.63)，O 10.53(10.57)，S 7.01(7.06)；HRMS(EI)(C55H45N3O6S2计算值)，m/z：907.2753(907.2750)。

本发明的技术方案主要是将结构式为：

的双光子荧光标记探针LP用于细胞内糖链抗原活检。