[发明专利]快速磁分离电化学免疫传感及检测金黄色葡萄球菌的方法

说明书

技术领域

本发明提供一种快速磁分离电化学免疫传感及其对金黄色葡萄球菌高灵敏检测方法，属于生物传感技术领域。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是一种广泛存在于大自然的革兰氏阳性球菌。金黄色葡萄球菌肠毒素(StaphylococcusaureusEnterotoxins，SES)是一种金黄色葡萄球菌分泌的细胞外毒素，能够导致食物中毒，可引发胸部疼痛、呕吐、腹泻、中毒休克等症状，其半数致死剂量为0.02μg/kg。含有较高蛋白质含量的食物如乳及乳制品，常被检测出有葡萄球菌肠毒素B(SEB)存在。SEB较稳定，经过高温数分钟加热数分钟后，仍有余留，应给予足够重视。

目前检测金黄色葡萄球菌的传统方法：平板计数法、多管发酵法与滤膜法。这三种方法都具一些共同的缺点如：检测步骤较为繁杂，检测周期较长，劳动强度较大。为适应食品工业的需要，这几年国内外发展出了几种快速检测金黄色葡萄球菌的方法如：小型生物化学测试、免疫学测试、基于核酸探针的方法、聚合酶链反应等。这些方法具有方便，快速等优点。但也存在一些缺点如：检测费用较高，对自动化的仪器依赖度较高等。而近年来，在环境监控和食品安全领域，生物传感器在病原体、有机物的检测中扮演着越来越重要的角色。鉴于其高敏感度和专一性，免疫传感已经被认为是最有效的检测工具之一。

CdTe量子点一般较为稳定，溶于水，能接受激发光产生荧光。在交联剂作用下，制备抗体功能化的量子点，可在抗体与量子点之间形成稳定的化学键，得到的连接产物结合牢固，较为稳定，可特异性检测抗原。磁性纳米球是纳米尺度的磁性材料，除了具有一般纳米粒子的光学和表面特性之外，磁性纳米球还具有催化活性，良好的磁导向，生物相溶，生物降解等性质，可与许多生物分子结合，使其表面功能化。Fe₃O₄是用的最多的磁性纳米球。Fe₃O₄粒子直径小、毒性低、灵敏度高、性能稳定、原材料易得，此外其表面积较大，表面活性也较高。因此可选择合适交联剂将特定抗体结合到磁性纳米球上，从而使磁性纳米球带有一定特殊功能。在交联试剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)作用下，功能化磁性纳米球可与特定的抗原相结合，在外磁场作用力下，具有磁性的功能化生物分子可向磁场方向移动，从而集中在特定的部位。

免疫磁珠分离技术，是利用抗原（或抗体）包被的磁珠与抗体（或抗原）特异性结合，再外加磁场的作用下，可将样品从复杂基质中分离出来，达到样品富集浓缩的目的。免疫磁珠分离技术快速且特异性强，具备固相化试剂的优点，不需对待检测细菌进行增菌，有助于降低原有检测手段的检测限。从而在食品、医学等方面有其巨大的应用价值。

发明内容

发明的目的在于提供一种操作简单，响应时间短，价格低廉，灵敏度高以检测金黄色葡萄球菌的生物传感器。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种用于检测金黄色葡萄球菌的电化学生物传感器，包括辅助电极、参比电极和工作电极。其特征在于：首先分别合成了抗体功能化的磁性纳米粒子（Fe₃O₄-Ab）和抗体功能化的量子点（QDs-Ab）。两种功能化纳米探针同时结合到金黄色葡萄球菌表面，并通过磁场作用迅速分离，结合电化学溶出伏安方法可实现食品中金黄色葡萄球菌快速检测。

一种快速磁分离电化学免疫传感及其对金黄色葡萄球菌高灵敏检测，按照下述步骤进行：

(1)CdTe量子点的制备：

6mM巯基丙酸(MPA)加入到2mMCdCl₂溶液中，用1M的NaOH溶液将PH调整到9.0，通入N₂混合30min，再缓慢加入0.0625MNaHTe溶液，形成暗黄色CdTe量子点。所获得的量子点溶液回流10h，可达粒径为2.6nm，浓度4.7μM。将制成的量子点溶液通过4℃条件下15000g超滤10min以除去过量的巯基丙酸，并反复润洗两次，最后用pH7.4的PBS定容，并置于4℃的冰箱中保存。

其中步骤（1）中各反应物按照Cd²⁺/MPA/HTe^-物质量比为1:3:0.5添加。

(2)CdTe量子点功能化：