[发明专利]华南紫萁离体再生体系建立的方法

说明书

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，是一种以孢子囊群为外植体的华南紫萁离体再生体系建立的方法。

背景技术

华南紫萁(OsmundavachelliiHook.)是紫萁蕨科紫萁属植物，产于亚洲亚热带湿润地区。分布于我国海南岛、两广、福建、江西、浙江、贵州、云南南部及香港，也产于越南、缅甸和印度。常野生于湿润的山地、草丛或溪边，是我国南部酸性土壤的指示植物。

华南紫萁具较高的观赏价值。植株高达1m，根状茎直立，圆柱状，叶簇生于顶部，似苏铁，株型美观，叶姿态优雅，可供庭园中栽植或室内盆栽观赏。华南紫萁的根茎及叶柄的髓部可入药，有清热解毒、止血生肌作用。主要用于外感、风热、头痛等症，也可治疗外伤出血、烫火伤、痈疖及腮腺炎。上世纪90年代末，何天士等人将其配制为药酒和药茶供人饮用，对人体保健有积极的作用，可解各种热毒症、预防癌症及其他疑难病症，性味平和，无副作用。相关的研究产品获得4项专利。

华南紫萁目前资源主要依靠野生，但自然条件下繁殖效率较低，人工繁殖一般采用分株方式进行，难以快速大规模栽培。由于华南紫萁集观赏和药用价值于一身，其潜在的市场需求非常大。利用组织培养技术建立蕨类植物再生体系，快速获得大量种苗，可以满足园林、保健市场对华南紫萁的需求，同时也间接保护了野生华南紫萁资源。

发明内容

本发明的目的在于提供一种华南紫萁离体再生体系建立的方法，即以华南紫萁的成熟孢子为外植体，经过外植体表面消毒、孢子无菌萌发、原叶体增殖、孢子体诱导与瓶苗移栽等步骤，建立了华南紫萁离体再生体系，从而快速可持续地获得大量种苗。

本发明采用下述技术方案来实现。华南紫萁离体再生体系建立的方法，包括以下步骤：

(1)外植体采集与表面消毒：剪取华南紫萁孢子叶，进行表面消毒。

(2)孢子无菌萌发：分离孢子叶上的孢子囊群，将其接种于孢子萌发培养基上进行培养。孢子萌发培养基配方为：改良Beneck基本培养基+0~15g/L蔗糖+6-苄氨基嘌呤(6-BA)0.2mg/L+2,4二氯苯氧乙酸(2,4-D)0.1mg/L+琼脂7g/L

(3)原叶体增殖培养：将步骤(2)孢子萌发形成的原叶体剪切至增殖培养基中进行原叶体增殖培养。每50d更换一次增殖培养基。增殖培养基配方为：改良Beneck基本培养基+15g/L蔗糖+6-BA0~0.6mg/L+2,4-D0.1mg/L+琼脂7g/L。

(4)孢子体的诱导：将步骤(3)形成的原叶体粉碎转接至孢子体诱导培养基诱导产生幼孢子体。孢子体诱导培养基配方为：改良Beneck基本培养基+赤霉素(GA₃)0~1.2mg/L+5g/L蔗糖+琼脂7g/L+水解酪蛋白100mg/L。

(5)生根培养与炼苗：将步骤(4)诱导的幼孢子体分离出来，转接至生根培养基诱导孢子体形成不定根。生根培养基配方为：改良Beneck基本培养基+10g/L蔗糖+6-BA0.05mg/L+2,4-D0.1mg/L(或NAA0.1mg/L)+琼脂7g/L发现不定根根尖突出后，随即在培养室内松开、虚掩瓶盖10d，期间培养基因水分较快消耗而收缩，但不致干涸，孢子体结构分化更完善。

(6)移栽：取出步骤(5)的孢子体幼苗，洗去根部附着的凝胶培养基，将幼苗移栽入经高温灭菌的基质中。定期浇水，覆盖薄膜，保持相对湿度90%以上。