[发明专利]一种以RNA介导的特异性敲除FGF5基因获得基因编辑绵羊的方法及其专用sgRNA

说明书

技术领域

本发明属于动物基因工程领域，涉及CRISPR/Cas9技术，具体涉及一种以RNA介导的特异性敲除FGF5基因获得基因编辑绵羊的方法及其专用sgRNA。

背景技术

基因组操作技术是近年基于基因组和基因信息技术发展起来的通过人工设计实现对特定基因或基因组靶位点进行精确编辑的前沿技术，目前已经成为生物医学、农业动物育种和模式动物等领域的研究热点。在动物育种领域，由于传统育种手段的增产潜力已经发挥到接近极限，利用高效稳定的基因组操作技术创新育种手段和提升现代动物育种效率和技术水平，对于育种新材料的创制和品种培育至关重要而且极为迫切。

近年来，科学家们根据细菌获得性免疫的原理，发明了基于CRISPR/Cas9的基因组编辑新技术，不仅大大降低了对动物进行基因敲除、基因修饰的难度，更是将动物转基因技术由传统的随机整合推向了高度精确的基因组定向删除、突变或插入，开创了转基因动物生产的新时代。CRISPR/Cas9系统是一个由核酸和蛋白质组成的核糖核蛋白复合物，它对靶点的识别依赖于核酸对核酸的识别，通过碱基的互补配对完成。打靶一个位点只需要在原有载体的基础上替换20-30bp的核苷酸，相当于合成一对引物，构建过程相对于ZFN和TALEN更加简单快捷，适合规模化、高通量的组装。相比ZFN和TALEN，Cas9介导的基因组编辑其靶标序列的特异性决定于一段小的与靶标序列互补的RNA。这种基于碱基互补配对原则的识别，相比较于蛋白质与DNA之间的相互作用要更加稳定和简单，能够实现一次操作同时突变两个以上基因或位点，大大提高了基因组编辑技术效率。

由于CRISPR/Cas9系统中发挥活性作用的核心部件为sgRNA和蛋白质，因此可以通过构建载体，体外转录获得RNA后，显微注射动物受精卵而获得打靶动物，在整个打靶过程中不存在外源DNA的整合。而且由于mRNA的不稳定性，不会长期存在生物体内，也不会对环境产生进一步影响，因而可以避免传统转基因导致的生物安全问题。也就是说，CRISPR/Cas9技术修饰的是一个物种自身的基因,采取mRNA或RNA作为基因打靶原材料，没有任何筛选用抗性基因，因而不存在生物安全性问题。而且，获得的最终产品是经过了遗传修饰的(通过转基因的方法定点修饰，因为这个系统是细菌里的,所以要靠转基因的方法转到动植物中)，但终产品里却可以不包含任何转基因的成分，大大提高了安全性。所以，在目前动植物新品种培育，尤其是转基因动物的制备中，CRISPR/Cas9介导的打靶系统被研究者广为采用。

成纤维细胞生长因子(FGFs)是一类调节细胞生长的多功能肽类生长因子。FGF5基因是FGF基因家族中的一员,在毛发生长周期中具有重要的调控作用。有研究表明，FGF5突变可以导致毛发生长周期中生长期的延长，从而使毛发的长度增加。近年来的研究表明FGF5基因可作为影响长毛兔产毛量潜在的主效基因，并且在狗、猫、羊等动物中检测FGF5基因的错义突变、多态性分析的研究，上述研究表明动物的长毛性状与FGF5基因的缺失突变相关。

传统的绵羊品种培育主要是通过基于表型选择的杂交改良等常规育种技术，在一定程度上取得了育种效果。但是常规育种周期长、预见性差、选择效率低，通过常规育种方法在品种改良上所获得的遗传增益日趋平缓，尤其在聚合高产、优质、抗逆等多个优良性状的品种选育方面进展不大，培育新品种的难度也越来越大，而且，在大动物基因组上实现修饰和改造的成本和技术要求仍然很高。新型的CRISPR/Cas9基因组编辑技术通过人工设计的核酸酶，既能够在体内基因组的特定位点实现双链断裂而造成定点突变，也可以在基因组特定的多个位点同时造成双链断裂实现长片段序列的删除、翻转与重复，甚至定点的实现染色体之间的易位，能够实现一次操作同时突变两个以上基因或位点，大大缩短育种的时间，加快育种进程，有望实现优良基因重组和聚合，达到定向选育优质、高产动物新品种的目标。

发明内容

本发明的目的是提供一种以RNA介导的特异性敲除FGF5基因获得基因编辑绵羊的方法及其专用sgRNA。

本发明提供了一种能够特异的靶向修饰绵羊FGF5基因的sgRNA(sgRNA_FGF5-1)，为序列表的序列4自5’末端第2至21位核苷酸所示的RNA或具有序列表的序列4自5’末端第2至21位核苷酸的RNA。本发明的实施例中，所述sgRNA_FGF5-1具体可为序列表的序列4所示的RNA。