[发明专利]虾夷扇贝毒素YTX纯品的提取、制备方法

权利要求书

1.虾夷扇贝毒素YTX纯品的提取、制备方法，其特征在于，步骤如下：

1）甲醇粗提

向装有藻糕的离心管中加入甲醇，超声萃取，离心，收集上清液并过滤；将滤液旋转蒸干后加入甲醇淋洗，然后超声，直至溶质溶解干净，量体积并放置于-80℃冰箱保存，备用；

2）经过两次分离提取

YTX粗分离：

使用2.4×32cm层析柱，以70g碱性氧化铝作为填料，CHCl₃–MeOH作为初始洗脱剂洗脱，然后进行梯度洗脱，依次加入150ml的CHCl₃–MeOH,150ml的MeOH，MeOH–1%氨水洗脱，收集MeOH–1%氨水部分，使用液相色谱串联质谱测其YTX浓度，合并含有YTX的洗脱液；将上述洗脱液旋转蒸干后加入甲醇淋洗，然后超声，直至溶质溶解干净为止，然后将溶解液过滤，置于玻璃瓶中，于-80℃冰箱保存，备用；

YTX纯化：

使用2.4×32cm层析柱，以60gC18作为填料，30%MeOH水溶液作为初始洗脱剂洗脱，然后进行梯度洗脱，依次用250ml的30%MeOH水溶液，140ml的40%MeOH水溶液，140ml的50%MeOH水溶液，140ml的60%MeOH水溶液，250ml的MeOH，梯度冲洗柱子，收集MeOH部分，使用液相色谱串联质谱测其YTX浓度，合并含有YTX的洗脱液，将上述收集液旋转蒸干后加入12ml甲醇淋洗，然后超声，直至溶质溶解干净为止，将溶解液过滤，置于玻璃瓶中，于-80℃冰箱保存，备用；

3）YTX纯品制备

使用半制备液相色谱-紫外光谱联用，以甲醇作为洗脱剂，用250mm×10mm的半制备柱，5μmC18作为填料，在273nm处检测洗脱液的紫外吸收强度，取3.64min处出峰，保留滤液，重复多次提取，得到波谱图上只有一个单峰，旋蒸干燥，得到固体YTX纯品。

2.根据权利要求1所述的虾夷扇贝毒素YTX纯品的提取、制备方法，其特征在于，甲醇粗提过程中将收集的上清液先于-80℃冰箱放置过夜，第二天再使用孔径为0.45μm滤膜过滤提取液，收集滤液。

3.根据权利要求1所述的虾夷扇贝毒素YTX纯品的提取、制备方法，其特征在于，初始洗脱剂洗脱过程为：用弯头胶头滴管，紧贴柱壁转圈上样3ml，开阀，待样品下移至液面相切时，用初始洗脱液淋洗柱壁2-3次，每次约1ml，然后进行梯度洗脱。

4.根据权利要求1所述的虾夷扇贝毒素YTX纯品的提取、制备方法，其特征在于，旋转蒸干后加入甲醇淋洗时，用弯头胶头滴管从平底旋转整瓶的瓶劲处不断淋洗。

5.根据权利要求1所述的虾夷扇贝毒素YTX纯品的提取、制备方法，其特征在于，YTX纯品制备过程中，重复多次提取，把纯化后收集液全部提取完成，合并取得滤液，旋转蒸发浓缩至2ml；浓缩后的滤液再次提取，并提取3.64min处出峰，合并所提取滤液，得到YTX纯化产品；将YTX纯化产品旋蒸浓缩，得到波谱图上只有一个单峰，旋蒸干燥，得到固体YTX纯品。

6.根据权利要求1所述的虾夷扇贝毒素YTX纯品的提取、制备方法，其特征在于，两次分离提取最后溶解液过滤均使用孔径为0.22μm的滤膜。