[发明专利]虾夷扇贝毒素YTX纯品的提取、制备方法

说明书

技术领域

本发明制备的YTX样品，可用于制作YTX毒素标准品，测定海洋食品（鱼、虾、贝等）中虾夷扇贝毒素YTX的含量，属于海洋食品安全领域必须要检测的指标之一。

背景技术

已有技术中，有国外文献报道过针对YTX毒素的研究，主要用于YTX毒素的研究，结构的表征，YTX毒素的衍生物的化学结构测定，YTX产毒环境与产毒的关系。国内文献未见对YTX毒素化学分子结构和性质的具体研究。

YTX标准品的制备，要求所得到的YTX产品必须有一定的产量，同时纯度达到一定的要求。目前的报道中，YTX的提取主要用于性质分析，提取出的量很小，且纯度不高，无法满足制备YTX检测标准品的需求。同时，现有文献没有涉及到YTX提纯的具体步骤及方法，无法满足制备YTX标准品的需要。

发明内容

本发明的目的是提供一种虾夷扇贝毒素YTX纯品的提取、制备方法，YTX样品可用于制作YTX毒素标准品，测定海洋食品（鱼、虾、贝等）中虾夷扇贝毒素YTX的含量，属于海洋食品安全领域必须要检测的指标之一。在我国食品安全，海洋产品出口等问题上具有重大的意义。

本发明的技术方案是这样实现的：虾夷扇贝毒素YTX纯品的提取、制备方法，步骤如下：

1）甲醇粗提

向装有藻糕的离心管中加入甲醇，超声萃取，离心，收集上清液并过滤；将滤液旋转蒸干后加入甲醇淋洗，然后超声，直至溶质溶解干净，量体积并放置于-80℃冰箱保存，备用；

2）经过两次分离提取

YTX粗分离：

使用2.4×32cm层析柱，以70g碱性氧化铝作为填料，CHCl₃–MeOH作为初始洗脱剂洗脱，然后进行梯度洗脱，依次加入150ml的CHCl₃–MeOH,150ml的MeOH，MeOH–1%氨水洗脱，收集MeOH–1%氨水部分，使用液相色谱串联质谱测其YTX浓度，合并含有YTX的洗脱液；将上述洗脱液旋转蒸干后加入甲醇淋洗，然后超声，直至溶质溶解干净为止，然后将溶解液过滤，置于玻璃瓶中，于-80℃冰箱保存，备用；

YTX纯化：

使用2.4×32cm层析柱，以60gC18作为填料，30%MeOH水溶液作为初始洗脱剂洗脱，然后进行梯度洗脱，依次用250ml的30%MeOH水溶液，140ml的40%MeOH水溶液，140ml的50%MeOH水溶液，140ml的60%MeOH水溶液，250ml的MeOH，梯度冲洗柱子，收集MeOH部分，使用液相色谱串联质谱测其YTX浓度，合并含有YTX的洗脱液，将上述收集液旋转蒸干后加入12ml甲醇淋洗，然后超声，直至溶质溶解干净为止，将溶解液过滤，置于玻璃瓶中，于-80℃冰箱保存，备用；

3）YTX纯品制备

使用半制备液相色谱-紫外光谱联用，以甲醇作为洗脱剂，用250mm×10mm的半制备柱，5umC18作为填料，在273nm处检测洗脱液的紫外吸收强度，取3.64min处出峰，保留滤液，重复多次提取，得到波谱图上只有一个单峰，旋蒸干燥，得到固体YTX纯品。

进一步地，甲醇粗提过程中将收集的上清液先于-80℃冰箱放置过夜，第二天再使用孔径为0.45um滤膜过滤提取液，收集滤液。

进一步地，初始洗脱剂洗脱过程为：用弯头胶头滴管，紧贴柱壁转圈上样3ml，开阀，待样品下移至液面相切时，用初始洗脱液淋洗柱壁2-3次，每次约1ml，然后进行梯度洗脱。

进一步地，旋转蒸干后加入甲醇淋洗时，用弯头胶头滴管从平底旋转整瓶的瓶劲处不断淋洗。

进一步地，纯品制备过程中，重复多次提取，把纯化后收集液全部提取完成，合并取得滤液，旋转蒸发浓缩至2ml；浓缩后的滤液再次提取，并小心提取3.64min处出峰，合并所提取滤液，得到YTX纯化产品；将YTX纯化产品旋蒸浓缩，得到波谱图上只有一个单峰，旋蒸干燥，得到固体YTX纯品。

进一步地，两次分离提取最后溶解液过滤均使用孔径为0.22μm的滤膜。

本发明的有益效果为：本发明虾夷扇贝毒素YTX纯品的提取、制备方法填补了国内对于贝类毒素标准品缺乏的空白，极大的促进了国内贝类毒素检测技术的发展和海洋食品安全的工作，对于国内海产品顺利出口到欧盟等发达国家，有着很大的促进作用。

附图说明

图1纯品制备过程检测一色谱分离波谱图。

图2纯品制备过程检测二色谱分离波谱图

图3纯品检测色谱分离波谱图。

具体实施方式