[发明专利]一种利用双向电泳体系获取罗非鱼肌肉蛋白质二维电泳图谱的方法

权利要求书

1.一种利用双向电泳体系获取罗非鱼肌肉蛋白质二维电泳图谱的方法，其特征是包括如下步骤：

(1)双向电泳用可溶性罗非鱼蛋白质的制备

选取罗非鱼肌肉组织，采用液氮研磨法研磨后，得粉末状组织，将粉末状组织用蛋白提取裂解液冰浴超声提取后，离心，取上清液，将上清液用丙酮沉淀、离心，收集蛋白沉淀，将蛋白沉淀用蛋白提取裂解液溶解后离心，取上清液即得双向电泳用可溶性罗非鱼蛋白质；

(2)检测双向电泳用可溶性罗非鱼蛋白质的浓度

采用Bradford法检测步骤(1)中获得的双向电泳用可溶性罗非鱼蛋白质的浓度；

(3)双向电泳

等电聚焦电泳：选取24cm、pH值为4～7的等电聚焦胶条，根据步骤(2)中的可溶性罗非鱼蛋白质的浓度，取一定体积的可溶性罗非鱼蛋白质至其质量为135～145μg，配制成上样液，将上样液置于等电聚焦仪进行等电聚焦电泳；

胶条平衡：将等电聚焦电泳后的胶条置于平衡液中进行平衡；

十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺SDS-PAGE凝胶电泳：胶条平衡结束后，将其取出置于电泳缓冲液中浸泡，用含有溴酚蓝的低熔点琼脂糖溶液封胶，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺分离胶进行SDS-PAGE电泳；

(4)凝胶染色

采用硝酸银染色法对SDS-PAGE凝胶进行染色；

(5)图谱扫描

用扫描仪对凝胶进行扫描获得罗非鱼肌肉蛋白质的二维电泳图谱。

2.根据权利要求1所述利用双向电泳体系获取罗非鱼肌肉蛋白质二维电泳图谱的方法，其特征是：步骤(1)中所述的蛋白提取裂解液包括以下组分：2.0mol·L^-1的硫脲、7.0mol·L^-1的尿素、质量体积百分含量为4％的CHAPs、65mmol·L^-1DTT、1％pH为3～10的Bio-Lyte。

3.根据权利要求1所述利用双向电泳体系获取罗非鱼肌肉蛋白质二维电泳图谱的方法，其特征是：步骤(2)中采用Bradford法检测步骤(1)中获得的双向电泳用可溶性罗非鱼蛋白质的浓度的具体过程是：取BSA配制一组具有浓度梯度的BSA溶液制作标准曲线，取步骤(1)中获取的双向电泳用可溶性罗非鱼蛋白质，根据制作的标准曲线，计算双向电泳用可溶性罗非鱼蛋白质的浓度。

4.根据权利要求1所述利用双向电泳体系获取罗非鱼肌肉蛋白质二维电泳图谱的方法，其特征是：步骤(3)中所述的上样液包括以下组分：135～145μg蛋白质、1％二硫苏糖醇、1％胶条缓冲液和1％溴酚蓝。

5.根据权利要求1所述利用双向电泳体系获取罗非鱼肌肉蛋白质二维电泳图谱的方法，其特征是：步骤(3)中等电聚焦电泳时，等电聚焦仪的参数为：500V线性升压60min，1000V快速升压60min，10000V快速升压180min，10000Vh快速聚焦250min。

6.根据权利要求1所述利用双向电泳体系获取罗非鱼肌肉蛋白质二维电泳图谱的方法，其特征是：步骤(3)中将等电聚焦电泳后的胶条置于平衡液中进行平衡时，依次置于平衡液1和平衡液2中，分别平衡12～18min。

7.根据权利要求6所述利用双向电泳体系获取罗非鱼肌肉蛋白质二维电泳图谱的方法，其特征是平衡液1包括以下组分：6mol·L^-1尿素、2％SDS、pH值为8.8的50mmol·L^-1Tris-HCl、20％的甘油、1％DTT；平衡液2包括以下组分：6mol·L^-1尿素、2％SDS、pH为8.8的50mmol·L^-1Tris-HCl、20％甘油、2.5％IAA。

8.根据权利要求1所述利用双向电泳体系获取罗非鱼肌肉蛋白质二维电泳图谱的方法，其特征是：步骤(3)中所述十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺分离胶的浓度为12.5％，SDS-PAGE电泳时，电泳起始功率为2W/胶，60min后升至17W/胶，直到溴酚蓝跑到下缘时结束。