[发明专利]一种利用双向电泳体系获取罗非鱼肌肉蛋白质二维电泳图谱的方法

说明书

技术领域

本发明属于双向电泳技术领域，具体涉及一种利用双向电泳体系获取罗非鱼肌肉蛋白质二维电泳图谱的方法。

背景技术

蛋白质组(proteome)指“细胞、组织或机体内的基因在特定生理条件下表达的所有蛋白质”，蛋白质组学(proteomics)是对一个机体的全部蛋白质进行系统的研究，包括蛋白质的变化、翻译后修饰及蛋白质与蛋白质之间的相互作用。蛋白质组学研究可以从蛋白质水平上对生物体的各种生理过程有更全面的认识，已成为生命科学研究的热点，而双向电泳(Two-dimensionalelectrophoresis，2-DE)是目前蛋白质组学研究中常用的蛋白质分离技术之一。以双向电泳技术为核心的蛋白质组学已广泛应用于生物学、生物化学和生物医学研究中，现逐渐延伸到水产科学及食品科学方面。

罗非鱼具有生长速度快、繁殖能力强、食性杂、抗病力强等特点，且骨刺少、肉质厚，是我国主要的淡水鱼养殖产品之一。不同品种和不同组织的双向电泳条件也各不相同，已有关于大弹涂鱼(Boleophthalmuspectinirostris)肝脏、大菱鲆(Scophthalmusmaximus)表皮、大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)肝脏、斑节对虾(Penaeusmonodon)血淋巴蛋白质双向电泳体系建立的研究，尚未有关于罗非鱼肌肉蛋白质双向电泳体系建立的报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种利用双向电泳体系获取罗非鱼肌肉蛋白质二维电泳图谱的方法，该方法通过双向电泳体系能获得罗非鱼肌肉蛋白质的二维电泳图谱。

本发明上述所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：一种利用双向电泳体系获取罗非鱼肌肉蛋白质二维电泳图谱的方法，包括如下步骤：

(1)双向电泳用可溶性罗非鱼蛋白质的制备

选取罗非鱼肌肉组织，采用液氮研磨法研磨后，得粉末状组织，将粉末状组织用蛋白提取裂解液冰浴超声提取后，离心，取上清液，将上清液用丙酮沉淀、离心，收集蛋白沉淀，将蛋白沉淀用蛋白提取裂解液溶解后离心，取上清液即得双向电泳用可溶性罗非鱼蛋白质；

(2)检测双向电泳用可溶性罗非鱼蛋白质的浓度

采用Bradford法检测步骤(1)中获得的双向电泳用可溶性罗非鱼蛋白质的浓度；

(3)双向电泳

等电聚焦电泳：选取24cm、pH值为4～7的等电聚焦胶条，根据步骤(2)中的可溶性罗非鱼蛋白质的浓度，取一定体积的可溶性罗非鱼蛋白质至其质量为135～145μg，配制成上样液，将上样液置于等电聚焦仪进行等电聚焦电泳；

胶条平衡：将等电聚焦电泳后的胶条置于平衡液中进行平衡；

十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺SDS-PAGE凝胶电泳：胶条平衡结束后，将其取出置于电泳缓冲液中浸泡，用含有溴酚蓝的低熔点琼脂糖溶液封胶，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺分离胶进行SDS-PAGE电泳；

(4)凝胶染色

采用硝酸银染色法对SDS-PAGE凝胶进行染色；

(5)图谱扫描

用扫描仪对凝胶进行扫描获得罗非鱼肌肉蛋白质的二维电泳图谱。

在上述利用双向电泳体系获取罗非鱼肌肉蛋白质二维电泳图谱的方法中：

步骤(1)中所述的蛋白提取裂解液包括以下组分：2.0mol·L^-1的硫脲、7.0mol·L^-1的尿素、质量体积百分含量为4％的CHAPs、65mmol·L^-1DTT、1％pH为3～10的Bio-Lyte。

步骤(2)中采用Bradford法检测步骤(1)中获得的双向电泳用可溶性罗非鱼蛋白质的浓度的具体过程优选是：取BSA配制一组具有浓度梯度的BSA溶液制作标准曲线，取步骤(1)中获取的双向电泳用可溶性罗非鱼蛋白质，根据制作的标准曲线，计算双向电泳用可溶性罗非鱼蛋白质的浓度。

采用Bradford法检测时，每个样品中均加入有Bradford染色液。

步骤(3)中所述的上样液包括以下组分：135～145μg蛋白质、1％二硫苏糖醇、1％胶条缓冲液和1％溴酚蓝。

其中，胶条缓冲液的成分包括pH3～10的Bio-Lyte，载体两性电解质，是BIO-RAD的一种市售产品，可以增加蛋白质的溶解性。