[发明专利]一种检测DNMT3A基因突变的引物与方法

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种检测DNMT3A基因突变的引物与方法。

背景技术

急性髓细胞性白血病（Acutemyeloidleukemia，AML）是髓系造血干/祖细胞恶性疾病。近年来，研究发现，在人类肿瘤疾病中，肿瘤相关基因会发生低甲基化或超甲基化现象，即DNA甲基化模式的改变与肿瘤的发生发展有关。基因组甲基化模式的建立和维持由DNA甲基转移酶（DNAmethyltransferases，DNMTs）负责完成。在哺乳动物中，主要存在3类具有催化活性的DNMTs，分别为DNMT1、DNMT3A、DNMT3B和1个缺少甲基转移酶活性的类似蛋白DNMT3L。其中，DNMT3A和DNMT3B主要起从头甲基化作用，是肿瘤遗传机制的重要分子。

目前有研究发现，DNMT3A基因丢失或发生突变导致造血干细胞的分化缺陷，据报道，DNMT3A基因突变在AML患者中的发生频率为17.8%-22.1%，与野生型DNMT3A的AML患者相比，DNMT3A基因突变患者往往为正常核型，并伴随NPM1、FLT3、IDH1等基因的突变。AML患者的DNMT3A基因最常见的突变位点为R882(R882H,R882C,R882P,R882S)。因此，检测DNMT3A基因的突变位点可以作为识别正常核型AML患者的预后指标。

中国专利申请201310459210.2公开了一种检测DNMT3A突变位点的方法、引物和试剂盒，该试剂盒包括样品基因组DNA抽提试剂、无水乙醇、检测体系PCR反应液、测序体系反应液、阳性对照品、阴性对照品和空白对照品，用于DNMT3A基因R882位点突变的检测存在反应体系复杂和检测步骤复杂的缺点。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种检测DNMT3A基因突变的引物与方法，该引物具有特异性好、灵敏度高等优点，实现了DNMT3A基因外显子23突变的准确检测。

本发明提供一种检测DNMT3A基因突变的引物，包括针对DNMT3A基因外显子23的上游引物TGTAAAACGACGGCCAGTAGGAGTTGGTGGGTGTGAG（SEQIDNO.1）和下游引物CAGGAAACAGCTATGACCATGATGTCCAACCCTTTTCG（SEQIDNO.2）。

进一步地，所述引物中外显子23的上游引物和外显子23的下游引物浓度比为1：1。

另外，本发明还提供一种检测DNMT3A基因突变的方法，包括如下步骤：A）提取DNA样品；B）采用权利要求1或2中所述的引物进行PCR扩增；C）对扩增产物进行凝胶电泳分析后，采用Sanger测序法检测，对检测结果进行分析。

优选地，所述步骤A）中的DNA样品为EDTA抗凝外周血或骨髓血的DNA样品。

优选地，所述步骤B）中的PCR扩增反应条件包括：阶段1：98℃3min；阶段2：98℃10s；阶段3：63℃30s；阶段4：72℃1min；阶段5：返回到阶段2，34个循环；阶段6：72℃5min；阶段7：25℃保温。

优选地，所述步骤C）中，采用Sequencher4.1.4软件对检测结果进行分析。

此外，本发明还提供检测DNMT3A基因突变的引物在制备检测DNMT3A基因突变试剂中的用途。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供了一种检测DNMT3A基因外显子23突变的引物，该引物的特异性好，准确性好，提高了检测效率。此外，本发明还提供了一种检测DNMT3A基因外显子23突变的方法，通过使用特异性的引物，具有特异性好、灵敏度高、准确性好等优点，DNMT3A基因突变可以作为识别正常核型AML患者中的不同亚型的预后指标，为临床用药提供指导。

附图说明

图1本发明提供的DNMT3A基因引物(DNMT3A_R882_M13F&DNMT3A_R882_M13R)扩增片段；

图2PCR扩增产物的凝胶电泳图；

图3DNMT3A基因外显子23(野生型)的部分测序图；

图4DDNMT3A基因外显子23(c.2645G>A)的部分测序图。

具体实施方式

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

实施例1、引物