[发明专利]蛋白制剂的高效液相色谱检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白制剂的高效液相色谱检测方法。

背景技术

蛋白制剂中，通常需要加入一些辅料，例如：甘露醇作为赋型剂，蔗糖作为稳定剂，三羟甲基氨基甲烷作为缓冲剂体系。为了控制蛋白制剂的成品质量，通常需要对其组分含量进行检测；但由于其中含有甘露醇、蔗糖等辅料，检测时各组分之间存在干扰，导致其检测方法往往比较繁琐、复杂。

目前，蛋白制剂的检测方法均需要采用两种不同的流动相进行梯度洗脱，实现对蛋白制剂中各个组分的分离，以避免各组分之间的干扰。例如，柏兆方等采用超高效纳升液相色谱-电喷雾串联质谱对重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白进行了分析，它采用特殊的富集柱和分离柱，并采用两种不同的流动相(流动相A：含0.1％甲酸的水溶液；流动相B：含0.1％甲酸的乙氰)进行梯度洗脱，实现重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白中各个组分的有效分离，避免各组分之间的干扰(柏兆方，林碧蓉，李萍，李卫华，刘炳玉，王红霞.《超高效纳升液相色谱-电喷雾串联质谱鉴定重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白》.分析化学研究简报，2009年7月，第37卷，第7期：1025～1028.)。

姚雪静等建立了一种测定注射用重组人B淋巴细胞刺激因子受体-抗体融合蛋白含量的方法，也是采用特殊的色谱柱，并采用两种不同的流动相(流动相A液：含0.1％三氟乙酸的水溶液，流动相B液：含0.1％三氟乙酸的乙腈溶液)进行梯度洗脱(A液从75％渐变至60％，同时B液从25％渐变至40％，洗脱时间：15min)(姚雪静，李壮林.《RP-HPLC法测定注射用重组人B淋巴细胞刺激因子受体-抗体融合蛋白的含量》.中国药房，2012年，第23卷，第33期.)。

高凯等建立了一种重组人B淋巴细胞刺激因子受体-抗体融合蛋白的质控方法，它使用Agilent Zorbax 300SBC18(5μm，4.6mm×250mm)色谱柱，采用两种不同的流动相(流动相A液：含0.1％三氟醋酸的水溶液；流动相B液：含0.1％三氟醋酸的乙腈溶液)进行梯度洗脱(洗脱梯度为：0～15min，B液：30％～45％；16～20min，B液：45％～30％)(高凯，陶磊，史新昌，裴德宁，王兰，李响，饶春明，王军志.《重组人B淋巴细胞刺激因子受体-抗体融合蛋白质控方法和质量标准的建立》.中国生物制品学杂志，2012年3月，第25卷，第3期.)。

可见，现有技术检测蛋白制剂的方法都比较繁琐、复杂，均需要采用两种不同的流动相进行梯度洗脱，才能实现对蛋白制剂中各个组分的分离。

因此，对于蛋白制剂而言，需要发明一种简便并能有效避免各组分之间相互干扰、实现对各组分有效检测的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供蛋白制剂的一种高效液相色谱检测方法。

本发明提供的蛋白制剂的高效液相色谱检测方法，包括以下步骤：

a、取蛋白制剂，用水溶解后，流动相稀释，制成供试品溶液；

b、取对照品，用水溶解，制成对照品溶液；

c、采用高效液相色谱分别对供试品溶液、对照品溶液进行检测，检测条件为：

色谱柱为氨基柱；流动相为乙腈-水溶液，乙腈与水的体积比为(65：35)～(80：20)。

进一步的，步骤a中，蛋白制剂为注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白。

进一步的，注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白包括以下组分：重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白、甘露醇、蔗糖和三羟甲基氨基甲烷。

进一步的，注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白包括以下重量份配比的组分：重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白25份、甘露醇40份、蔗糖10份和三羟甲基氨基甲烷1.2份。

进一步的，步骤a中，供试品溶液的浓度为2.5mg/ml。

进一步的，步骤b中，对照品为甘露醇、蔗糖、重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白、三羟甲基氨基甲烷中的任意一种或两种以上。

进一步的，步骤c中，色谱柱为Agilent ZORBAX Carbohydrate，规格为4.6mm×250mm，填充剂粒径为5μm。

进一步的，步骤c中，乙腈与水的体积比为(75：25)～(80：20)。

进一步的，步骤c中，流动相的流速为1～1.5ml/min；优选的，流动相的流速为1.5ml/min。

进一步的，步骤c中，色谱柱的柱温为30℃；检测器为示差折光检测器，检测器池温度为35℃；上样体积为10μl～20μl。