[发明专利]密执安棒形杆菌不同亚种的条形码鉴定方法及其专用引物

说明书

本发明公开了密执安棒形杆菌不同亚种的条形码鉴定方法及其专用引物。本发明提供了鉴定密执安棒形杆菌不同亚种的条形码引物，其由引物cmhspF和引物cmhspR组成；所述引物cmhspF的核苷酸序列为序列表中序列1，所述引物cmhspR的核苷酸序列为序列表中序列2。本发明的实验证明了，使用本发明所提供的引物组cmhspF和引物cmhspR，在验证中100％扩增到密执安棒形杆菌各亚种，测序成功率为100％，能够有效对该种内不同亚种进行鉴定,可在进境植物及其产品检疫中应用，防止病原细菌的传入传出,也可在国内的植保植检站、科研院所、农业生产企业及农户中推广应用。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种鉴定密执安棒形杆菌不同亚种的条形码方法及其专用引物。

背景技术

棒形杆菌属(Clavibacter，原为Corynebacterium)细菌，1954年，Davis将含有2,4二氨基丁酸的一些菌归类并设立了棒形杆菌属新种－密执安棒形杆菌种(Clavibactermichiganensis)。根据寄主植物的不同一般将密执安棒形杆菌(Clavibactermichiganensis)分为五个亚种：诡橘亚种(Clavibacter michiganensissubsp.insidiosus，苜蓿细菌性萎蔫病菌)、密执安亚种(Clavibacter michiganensissubsp.michiganensis，番茄溃疡病菌)、内布拉斯加亚种(Clavibacter michiganensissubsp.nebraskensis，玉米内州萎蔫病菌)、环腐病亚种(Clavibacter michiganensissubsp.sepedonicus,马铃薯环腐病菌)、棋盘状亚种(Clavibacter michiganensissubsp.tessellarius，小麦细菌性花叶病菌)。上述病菌均能通过种子或种苗进行远距离传播，并能造成严重危害，前四个亚种被列为中华人民共和国进境植物检疫性有害生物。

口岸检疫是防控有害生物传入传出的有效途径，准确的检测鉴定是口岸检疫的重要措施，因此加强对该属病原细菌的检测鉴定技术研究具有重要意义。国内外研究人员采用了多种方法如直接观测法、生物学测定法、血清学检测和分子生物学检测法等对该属细菌的检测鉴定做了大量的研究。随着育种的国际化和植物种质资源引进交流大幅度增加，口岸检疫对该属检疫性细菌的检测鉴定方法也提出了更高的要求。棒形杆菌属下的四个检疫性植物病原细菌，目前常用的分子检测方法主要有PCR凝胶电泳、实时荧光PCR、LAMP等方法，这类方法适合于目标细菌的特异性检测，但对于未知病原菌的鉴定不适合。

DNA条形码技术是近年来出现的一种新的物种鉴定技术，由加拿大Guelph大学的分类学家Paul Hebert在2003年首次提出，其在物种标准化鉴定方面的优势已备受关注。线粒体细胞色素C氧化酶亚基I(COI)基因作为动物的DNA条形码已广泛应用于物种鉴定中；在植物上已选定叶绿体rbcl和matK基因作为基本的DNA条形码；真菌学家正对真菌类群进行不同基因片段的筛选与评价，以ITS作为真菌的首选DNA条形码。条形码技术是分类学中辅助物种鉴定的新技术，它代表了生物分类学研究的一个新方向，而且随着测序技术的发展和普及，DNA条形码技术为出入境境检验检疫提供了一种简单而有效而且容易标准化的方法。在细菌方面，虽然很早就利用16S rDNA序列进行分类与鉴定，但由于16S rDNA序列的保守性强，区分能力有限，对于种及种下阶元的鉴定很难。植物病原细菌在分类上与经典的细菌分类还不尽相同，自然感染寄主的差异是病原细菌鉴定的一个重要指标，但在现实检测中依靠寄主差异进行检测鉴定具有很大难度，目前很多分类学家和检测技术人员正研究寻找适合细菌种及种下阶元快速鉴定的通用DNA条形码基因。

发明内容

本发明的一个目的是提供鉴定密执安棒形杆菌不同亚种的条形码引物。

本发明提供鉴定密执安棒形杆菌不同亚种的条形码引物，为对片段A进行扩增和/或测序使用的引物，所述片段A为以密执安棒形杆菌不同亚种的基因组DNA为模板，用序列1所示的引物和序列2所示的引物进行扩增得到的片段。