[发明专利]脂蛋白(a)多克隆抗体的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及脂蛋白(a)多克隆抗体的制备方法。

背景技术

脂蛋白(a)主要是在肝脏合成，主要的功能是阻止血管内血块溶解，促进动脉粥样硬化形成。脂蛋白水平持续升高与心绞痛、心肌梗死、脑溢血有密切关系。是冠心病的独立危险因子。Lp(a)是一种富含胆固醇的脂蛋白，核心部分为中性脂质和apoB-100分子，其外围包绕着亲水性的apo(a)，二者以二硫键共价连接；其中apo(a)是Lp(a)的特征性糖蛋白成分，主要由一种称为Kringle的特征性结构构成，Kringle由80～114个氨基酸残基组成，依靠三个内部二硫键稳定。

从apo(a)的N-末端到C-末端.所有的Kringle域通过两两之间的大约30个氨基酸的中间序列依次相连。除最靠近C端的Kringle域与纤溶酶原中的Kringle5同源外，其余Kringle域均与纤溶酶原中的Kringle4同源，并依次被命名为KringleIVl-10型。在所有这10型的KringleIV中，不同个体的Kringle2型的串联重复数一般在3-43之间变化，因此Apo(a)的分子量也就在300-800kDa的范围中变化。KringleIV9型中有7个半胱氨酸，其中未参与分子内二硫键的第4057位半胱氨酸(Cys4057)与载脂蛋白B-100中的第4326位半胱氨酸(Cys4326)肜成分子间二硫键，进而组成完整的Lp(a)。

现有技术中制备脂蛋白(a)的多克隆抗体一般是采用全长脂蛋白(a)的重组蛋白来免疫动物，由于脂蛋白(a)的蛋白含较多的重复片段，制得的抗体多是针对这些重复片段上的抗原决定簇，使得多抗的特异性很低，结合能力很不均一，不能用于免疫检测试验。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种特异性好的脂蛋白(a)多克隆抗体的制备方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

脂蛋白(a)多克隆抗体的制备方法，包括：基因的克隆、基因的表达、重组蛋白的纯化、免疫动物和纯化抗体，通过KringleIV1片段序列作为免疫原制备脂蛋白(a)多克隆抗体。

进一步地，所述免疫原采用酵母表达系统分泌表达。

进一步地，所述基因的克隆方法为：设计一对含限制性酶切位点的引物，扩增脂蛋白(a)基因的KringleIV1片段，用限制性内切酶切割酵母分泌表达载体的质粒DNA和KringleIV1片段DNA，然后体外使两者相连接，再用所得到重组质粒转化细菌，验证正确后提取重组质粒，转化酵母菌感受态细胞。

进一步地，所述重组蛋白的纯化方法为：先浓缩含重组质粒的酵母菌发酵培养液，然后浓缩液按照先疏水，后阴离子交换层析，再分子筛纯化，获得重组蛋白纯品。

进一步地，所述免疫动物的方法为：首次免疫采用弗氏完全佐剂将纯化的蛋白进行乳化，每只小鼠注射一定量纯化的蛋白，然后采用弗氏不完全佐剂乳化纯化的蛋白，以21天为间隔进行第2-3次免疫。

进一步地，所述纯化抗体的方法为：利用饱和硫酸铵法初步纯化血清，然后再用溴化氰活化的琼脂糖4B偶联脂蛋白(a)蛋白做亲和层析。

本发明提供的脂蛋白(a)多克隆抗体的制备方法，采用单拷贝的KringleIV1片段来制备多抗，得到的抗体只针对KringleIV1结构域部分，专一性较高，效果好于用全长脂蛋白(a)来制备的多克隆抗体。

附图说明

图1是本发明实施例提供的使用全长脂蛋白(a)和本发明的脂蛋白(a)片段制备的多抗进行WesternBlot的图。其中泳道1为全长脂蛋白(a)制备的多抗，泳道2为本发明实施例1制备的多抗。

具体实施方式