[发明专利]一种酶制剂，制备方法及其在降解苏丹红上的应用

说明书

本发明公开了一种降解苏丹红I,II,III,IV的酶制剂及其制备方法。包括如下步骤：（1）将单色云芝菌株由斜面培养基转接入种子液中培养，然后转入装有基础液体培养基的三角瓶中，振荡培养，发酵液经过滤得到菌丝体，菌丝体用磷酸缓冲液洗涤多次，随后收集菌丝体，低温保藏备用；（2）菌丝体加入液氮后研磨成均一粉末，加入磷酸缓冲液，离心后取上清液；（3）将上述粗酶液采用40%硫酸铵沉淀，离心得沉淀即为酶制品。本发明的产品酶制剂为天然来源的产物，具有工艺简单、适合大规模工业化生产等特点，制备的酶制剂可以有效降解苏丹红I,II,III,IV染料，具有降解效率高，降解周期短，降解后的溶液成分简单等特点，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种酶制剂及其制备方法，并将其酶制剂应用于降解苏丹红上，属于生物工程和环境污染物处理领域。

背景技术

苏丹红是一种亲脂性偶氮类化学染色剂(非食品添加剂)，主要用于油彩、机油、蜡和鞋油等产品的染色，在食品中非天然存在，主要包括I、II、III和IV四种类型。该类物质具有致突变性和致癌性，对人体的肝肾器官具有明显的毒性作用，在我国禁止使用于食品中。因此，环境中的苏丹红的存在直接影响人类身体健康。目前报道苏丹红的研究主要集中在食品中苏丹红含量的分析与检测方面，而对环境中苏丹红的降解方法研究较少，相关报道为TiO2光催化降解和一种锐顶镰孢菌的微生物降解。因此，研究环境中苏丹红的降解具有重要的现实意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种降解苏丹红I,II,III,IV的微生物酶制剂及其制备方法，该方法具有工艺简单、适合大规模工业化生产等特点，制备的酶制剂催化活性高、酶活稳定，存储运输方便。

本发明的一种降解苏丹红I,II,III,IV的酶制剂的制备方法，包括：

(1)将微生物菌种置于斜面培养基活化后置于无菌操作环境下，用接种针划取0.5cm×0.5cm的菌块接种于预先设有种子培养基的摇瓶中，置于转速为120r/min的恒温振荡器中，在28℃下恒温培养4天，得到种子液；

(2)将种子液转入含有发酵培养基的摇瓶中，在转速为120r/min的恒温振荡器中，28℃下恒温培养7天；将培养好的发酵液离心10min收集菌丝体；

(3)用50mM磷酸缓冲液清洗菌丝体后再在液氮下研磨至均一粉末，收集菌丝体粉末，加入50mM磷酸缓冲液，置于10000rpm冷冻离心机中4℃离心10min后取上清液即为粗酶液；然后在上清液中加入硫酸铵至终浓度为40％wt，在4℃下放置24h后置于10000rpm冷冻离心机中4℃离心10min，所得沉淀即为酶制剂。

所述步骤(1)中的微生物为单色云芝(Coriolus unicolor)。

所述步骤(1)中的斜面培养基为马铃薯琼脂培养基(PDA)，即将200g/L的去皮土豆浆液与20g/L的葡萄糖和20g/L琼脂经热溶混匀制得，pH自然。

所述步骤(1)中的种子培养基为马铃薯液体培养基(PDB)，即将200g/L的去皮土豆浆液与20g/L的葡萄糖经混合后制得，pH自然。

所述步骤(2)中的发酵培养基为马铃薯基础培养基(SPM)，即将200g/L的去皮土豆浆液与20g/L的葡萄糖，3g/L KH₂PO₄，1.5g/L MgSO₄·7H₂O和微量维生素B1经混合后制得，pH 6.0。

所述步骤(3)中的菌丝体与磷酸缓冲液的添加比例为，菌丝体湿重/溶液体积＝1/1.5。

所述步骤(3)中酶制剂分子量范围经SDS-PAGE分析为50-85KD，该酶制剂中还包括分子量为55KD的多酚氧化酶。