[发明专利]检测人类IDH1基因突变的方法及其试剂盒

权利要求书

1.一种检测人类IDH1基因突变的荧光定量PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)在IDH1R132H反应混合液中加入从样品中提取的、作为模板的人类基因组DNA，形成R132H反应体系并进行荧光定量PCR扩增，还在IDH1内标反应混合液中加入从同一样品中提取的、作为模板的人类基因组DNA，形成内标反应体系并进行荧光定量PCR扩增，其中：

所述IDH1R132H反应混合液中包括：具有如序列表中SEQIDNo.1所示序列的IDH1R132H前向引物、具有如序列表中SEQIDNo.2所示序列的IDH1R132H反向引物和含有荧光染料的PCR预混液；

所述IDH1内标反应混合液中包括：具有如序列表中SEQIDNo.3所示序列的IDH1内标前向引物、具有如序列表中SEQIDNo.4所示序列的IDH1内标反向引物和含有荧光染料的PCR预混液；

(2)结果判断：首先确定人类基因组DNA在R132H反应体系进行荧光定量PCR扩增时的突变Ct值，然后确定同一样本在内标反应体系的Ct值，对Ct值进行分析。

2.根据权利要求1所述的检测人类IDH1基因突变的荧光定量PCR方法，其特征在于，

所述在IDH1R132H反应混合液中加入从样品中提取的、作为模板的人类基因组DNA为：在10μLIDH1R132H反应混合液中加入5μL、浓度为10ng/μL的人类基因组DNA，其中：在IDH1R132H反应混合液中IDH1R132H前向引物、IDH1R132H反向引物和含有荧光染料的2×PCR预混液的体积比为(1-2)：(1-2)：(7-8)，优选为1.25：1.25：7.5；在IDH1R132H反应混合液中IDH1R132H前向引物和IDH1R132H反向引物的浓度均为2-6μM，优选4-5μM，更优选4.8μM；

所述在IDH1内标反应混合液中加入从同一样品中提取的、作为模板的人类基因组DNA为：在14μLIDH1内标反应混合液中加入1μL、浓度为10ng/μL的同一样品中提取的人类基因组DNA，其中：每14μLIDH1内标反应混合液中有IDH1内标前向引物0.3-0.5μL、IDH1内标反向引物0.3-0.5μL和含有荧光染料的2×PCR预混液7-8μL，不足14μL的体积用水或缓冲液补足，优选的每14μLIDH1内标反应混合液中有IDH1内标前向引物0.3125μL、IDH1内标反向引物0.3125μL和含有荧光染料的2×PCR预混液7.5μL；在IDH1内标反应混合液中IDH1内标前向引物和IDH1内标反向引物的浓度均为2-6μM，优选4-5μM，更优选4.8μM。

3.根据权利要求1或2所述的检测人类IDH1基因突变的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述荧光定量PCR方法的扩增过程为：(1)95℃、3min、循环数为1；(2)95℃、15s，68℃、20s，循环数为18；(3)95℃、15s，57.6℃、20s，循环数为24；(4)升温至95℃。

4.根据权利要求3所述的检测人类IDH1基因突变的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述对Ct值进行分析的步骤为：

当样品在R132H反应体系的突变Ct值大于或等于阴性临界值19时，则该样品的R132H突变为阴性或小于本试剂盒的检测最低阈值，

当样品在R132H反应体系的突变Ct值小于阴性临界值19时，按照以下标准进行判断：当该样品在R132H反应体系的突变Ct值小于或等于阳性临界值16时，则该样品的R132H突变为阳性，即强阳；当该样品在R132H反应体系的突变Ct值大于阳性临界值16时，则计算R132H反应体系的△Ct，ΔCt值＝R132H反应体系突变Ct值-该样本在内标反应体系的Ct值，若反应体系的△Ct值小于相应的△CtCut-off值9，则该样品的R132H突变也为阳性，即弱阳，若反应体系的△Ct值大于或等于相应的△CtCut-off值9，则该样品的R132H突变为阴性或低于本试剂盒的检测最低阈值。