[发明专利]检测人类IDH1基因突变的方法及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测基因突变的方法及其试剂盒，特别涉及一种检测人类IDH1基因突变的方法及其试剂盒。

背景技术

神经胶质瘤简称胶质瘤，是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤，约占所有颅内原发肿瘤的一半，广义上是指所有神经上皮来源的肿瘤，狭义上则是指源于各类胶质细胞的肿瘤。通用WHO分级根据非典型性、核分裂指数、内皮细胞增殖和坏死程度分为4级：I级：以良性毛细胞型星形细胞瘤为主，占胶质瘤5％左右，通常可以治愈；II级：为一般的星形细胞瘤或混合性少突星形细胞瘤，占胶质瘤的30～40％左右；III级：为间变型星形细胞瘤，占胶质瘤的15～25％左右，一般由II级演变而来；IV级：为胶质母细胞瘤，占胶质瘤的1/3左右。低级别的胶质瘤在临床上主要是指WHO分类为星形细胞瘤I与II级，也包括少突胶质细胞瘤及混合性少突星形细胞瘤。

异柠檬酸脱氢酶(IDH)家族包括以NAD或NADP为辅助因子，催化异柠檬酸的氧化脱羧反应生成α-酮戊二酸的酶类，同时分别生成NADH或NADPH。在哺乳动物细胞中，IDH同工酶有以下三种形式：依赖NAD的线粒体IDH1，依赖NADP的线粒体IDH2，依赖NADP的胞质IDH3。编码依赖NAD的人IDH1的IDH1基因位于染色体2q33.3，并且定位于细胞质和过氧化物酶体中；编码依赖NADP的线粒体IDH2酶的IDH2基因位于染色体15q26.1。尽管IDH1和IDH2都参与了细胞内氧化损伤的防御机制，但IDH1在脂质的代谢机制中也发挥了重要作用。

大量研究证实，代谢的异常是引发肿瘤发生、发展的因素之一。IDH基因突变发生在肿瘤的早期，并且原发灶和转移灶的IDH基因高度保持一致。一般认为，IDH基因状态不会因治疗而发生变化。IDH基因在多种肿瘤中发生了突变，其发生率在结直肠癌约为40％，胰腺癌为90％以上，肺癌约为15％。IDH1基因突变主要集中发生在第2外显子的12和13密码子R>H(≥90％)称为R132H，这些突变破坏了IDH1蛋白内在的GTPase活性，从而使得IDH1蛋白处于持续活性状态。美国国家综合癌症网络(NCCN)临床实践指南(第二版，2014)将有无IDH1/2基因突变作为评估低级别胶质瘤患者风险级别的指标之一。

以往胶质瘤诊断及其分级主要依赖组织病理学，但仅靠组织形态学，特别是立体定向取材小标本，使组织缺乏典型病变，常常不能根据肿瘤的密度、异型性、血管增生、坏死等进行分级。当取材为肿瘤(尤其低级别胶质瘤)边缘时，或肿瘤治疗后判断是否存在复发情况时，区分这些胶质细胞是肿瘤还是反应性增生就显得十分困难。而直接测序法检测基因突变则存在步骤繁琐、工序复杂、费时费力的不足。

扩增阻碍突变系统(amplificationrefractorymutationsystem，ARMS)于1989年建立，用于对已知突变基因进行检测。该法通过设计突变特异性ARMS引物，其3’末端碱基与待检测突变型的突变碱基匹配，用于特异性扩增突变模板。ARMS的检测灵敏度依赖于ARMS引物的特异性和反应条件如酶、镁离子浓度等的优化。为了增加引物的特异性，减少引物与靶DNA发生错配时的错配延伸，可通过在引物3’端的第2-3个碱基引入另外一个或者两个错配碱基，使之与模板之间形成多重错配以阻止错误延伸。相比于组织病理学诊断方法，应用ARMS将显著提高IDH1基因突变检测的效率、灵敏度及特异性。

荧光定量PCR方法是分子诊断领域应用最广的技术之一，该方法灵敏度高、可实时定量，是适合临床大规模使用的方法。IDH1基因序列中GC含量很高，因此片段扩增的难度很大。

发明内容

为了克服上述现有技术中的缺陷，同时实现对人类IDH1基因突变的检测并计算样本的突变率，从而为肿瘤预后判断、靶向用药提供参考，本发明提供了一种检测人类IDH1基因突变的方法及其试剂盒，该检测方法和应用该方法的试剂盒将特异性引物用于荧光定量PCR方法中，可以克服IDH1基因序列GC含量高、难以扩增等不利条件影响，对R132H位点突变实现有效的鉴别，检测灵敏度达到1％。

一种检测人类IDH1基因突变的荧光定量PCR方法，包括以下步骤：

(1)在IDH1R132H反应混合液中加入从样品中提取的、作为模板的人类基因组DNA，形成R132H反应体系并进行荧光定量PCR扩增，还在IDH1内标反应混合液中加入从同一样品中提取的、作为模板的人类基因组DNA，形成内标反应体系并进行荧光定量PCR扩增，其中：