[发明专利]一种奶牛乳腺上皮细胞永生化方法

权利要求书

1.一种奶牛乳腺上皮细胞永生化方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)接种奶牛乳腺上皮细胞；

2)待细胞生长至密度大约为50％-70％时，弃上清液，用PBS清洗细胞；

3)将泛嗜性和兼嗜性的HPV16E6和E7病毒液加入步骤2)中的奶牛乳腺上皮细胞中；

4)将步骤3)中获得的混合液离心，留取上清液；

5)将步骤4)中获得的上清液放置37℃、5％CO₂培养箱中孵育24h；

6)吸弃步骤5)中获得混合液的上清液，加DMEM/F12培养基继续培养；

7)待细胞密度汇合至70％-80％时，用抗生素筛选阳性克隆。

2.如权利要求1所述的一种奶牛乳腺上皮细胞永生化方法，其特征在于，在步骤3)中的泛嗜性和兼嗜性的HPV16E6和E7病毒液中加入聚凝胺。

3.如权利要求2所述的一种奶牛乳腺上皮细胞永生化方法，其特征在于，所述聚凝胺的浓度为6μg/ml。

4.如权利要求1或3所述的一种奶牛乳腺上皮细胞永生化方法，其特征在于，在步骤4)中获得的上清液中加入刺激因子。

5.如权利要求4所述的一种奶牛乳腺上皮细胞永生化方法，其特征在于，所述刺激因子为表皮生长因子、氢化可的松、催乳素和胰岛素-转铁蛋白-硒。

6.如权利要求5所述的一种奶牛乳腺上皮细胞永生化方法，其特征在于，所述刺激因子的加入量分别为：终浓度为20ng/ml表皮生子因子、1μg/mL氢化可的松、和4ug/ml催乳素和1倍胰岛素-转铁蛋白-硒。

7.一种建立永生化奶牛乳腺上皮细胞系的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a)将采集到的奶牛乳腺组织在培养基中剪碎后，将其上清液接种在培养瓶中进行组织块原代培养；

b)采用权利要求1所述的方法永生化法奶牛乳腺上皮细胞；

c)筛选阳性克隆，进行细胞系的培养。