[发明专利]一种奶牛乳腺上皮细胞永生化方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及细胞原代培养、单克隆细胞获得、westernblot检测E6、E7病毒在奶牛乳腺上皮细胞的表达和建立奶牛乳腺上皮细胞系的方法。

背景技术

奶牛乳腺上皮细胞(BMEC,Bovinemammaryepithelialcell)具有合成和分泌乳蛋白的功能，对微生物入侵乳腺组织具有防御作用。同时，它是乳腺组织重要的反应细胞。因此，进行奶牛乳腺上皮细胞的原代培养和细胞永生化被视为奶牛泌乳营养调控和奶牛乳房炎发病机制研究重要细胞模型。

国内外基本上采用酶消化法分离培养原代培养奶牛乳腺上皮细胞(WangMZ,XuBL,WangHR,etal.，“EffectsofarginineconcentrationontheinvitroexpressionofcaseinandmTORpathwayrelatedgenesinmammaryepithelialcellsfromdairycattle”，PLosOne,2014(5):e95985)，此方法能够快速获得原代奶牛乳腺上皮细胞且成纤维细胞较少。然而，获得的奶牛乳腺上皮细胞由于经过高浓度酶长时间消化，细胞膜的受体蛋白受到严重的破坏，导致一系列的信号转导通路受阻，无法很好地实现奶牛乳腺上皮细胞的生理功能。

在国内进行的奶牛乳腺上皮细胞的培养相关试验(陈建晖,佟慧丽，李庆章等，“奶牛乳腺上皮细胞系的建立”2009，40(5):743-747)中，这些细胞只能进行有限的传代培养，并不能很好的保存奶牛乳腺上皮细胞系。与之相比，国外的奶牛乳腺上皮细胞系传代次数较多。然而，在利用奶牛乳腺上皮细胞系进行传代过程中，随着细胞传代数的增加，奶牛乳腺上皮细胞系将会失去乳腺组织生理功能，如：染色体的核型改变，呈现单倍体或多倍体。染色体数目改变都将造成试验数据的误差，甚至使得有些奶牛乳腺上皮细胞系根本不能表达乳蛋白，这样就失去了利用奶牛乳腺上皮细胞来研究泌乳营养调控及其泌乳机制的意义。因此，建立功能性的永生化奶牛乳腺上皮细胞系迫在眉睫。

病毒法是使得细胞永生化的方法之一，能够有效地将靶基因整合到宿主细胞的基因组中。与传统的转染和电穿孔转基因方法相比，此方法对细胞没有毒害、感染效率高且能稳定表达。目前使细胞永生化的病毒基因较多，如，hTERT、SV40、HPV16E6E7等病毒基因。其中，HPVE6和E7病毒基因是来自于女性宫颈癌细胞表达的产物，能够使人上皮细胞永生化(TsaoSA,WangXH,LiuY,“EstablishmentoftwoimmortalizednasopharyngealepithelialcelllinesusingSV40largeTandHPV16E6/E7viraloncogenes”.BiochimicaetBiophysicaActa,2002(1590):150-158)。HPVE6和E7病毒基因分别使得人类上皮细胞永生化的两个重要信号通路pRb-p16INK4a和p53失活，从而使细胞分别绕过M1和M2期，最终使细胞具有无限增值的能力。然而，目前尚无HPVE6和E7能够使奶牛乳腺上皮细胞永生化的报道。因而，将上述人上皮细胞的永生化方法应用到奶牛乳腺上皮细胞具有以下几点难点和疑点：1)在利用病毒法将目的基因转导进入奶牛乳腺上皮细胞内时，病毒骨架上的包膜糖蛋白Vsvg是否能够结合奶牛乳腺上皮细胞脂质，虽然目前研究中，Vsvg蛋白能够结合大多数人或小鼠上皮细胞膜上的脂质，但是尚未见其能够结合奶牛乳腺上皮细胞膜上的脂质的报道；2)由于病毒的滴度低，加上原代奶牛乳腺上皮细胞“无法快速分离导致细胞繁殖慢”的特点，会造成感染细胞效率低。

发明内容

针对上述现有技术中的难点和疑点，本发明提供了一种高效率地利用HPVE6和E7病毒基因对奶牛乳腺上皮细胞进行永生化的方法，以及一种建立生长速度快和稳定连续传代的奶牛乳腺上皮细胞系的方法，从而获得具有生理功能的奶牛乳腺上皮细胞，为奶牛乳腺上皮细胞的泌乳营养调控和奶牛乳房炎的发病机制研究提供实验细胞素材。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种奶牛乳腺上皮细胞永生化方法，其特征在于，在采用HPVE6和E7病毒感染原代奶牛乳腺上皮细胞使其永生化时，添加泛嗜性和兼嗜性的病毒颗粒。与增加单一嗜性的病毒颗粒相比，这样能够与奶牛乳腺上皮细胞表面结合更多的跨膜分子，从而增加病毒感染效率。

其中，采用以下病毒法永生化原代奶牛乳腺上皮细胞，包括以下步骤：

1)接种奶牛乳腺上皮细胞；