[发明专利]一株重组表达γ-内酰胺酶的枯草芽孢杆菌、固定化及应用

权利要求书

1.一重组表达载体，其特征是：所述重组表达载体的骨架为pMA5，其包含有来源于Delftiasp.CGMCC5755来源的(+)-γ-内酰胺酶基因，核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.1所示，其编码氨基酸序列如序列表中SEQIDNo.2所示。

2.一种重组表达转化体，其特征在于：其包含如权利要求1所述的重组表达载体或内酰胺酶基因。

3.如权利要求2所述的重组表达转化体，其特征在于：其为将权利要求1所述的重组表达载体转化至宿主微生物中制得的基因工程菌；所述的表达宿主为枯草芽孢杆菌，较佳的为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)168。

4.一种重组(+)-γ-内酰胺酶的制备方法，其特征在于包含如权利要求3所述的重组表达转化体，获得重组(+)-γ-内酰胺酶。

5.如权利要求4所述的重组(+)-γ-内酰胺酶的制备方法，其特征在于其包括如下步骤：将如权利要求3所述的重组表达转化体接种至培养基中过夜培养获得种子液，将种子液按2～5％的接种量将种子液转接至3L发酵罐中培养，过程中控制溶氧不低于15％，pH在7.0左右，37℃培养12h后收集细胞，并冷冻干燥获得重组(+)-γ-内酰胺酶；所述的培养基包括：胰蛋白胨20g/L，酵母提取物16g/L，葡萄糖4g/L，NaCl5g/L，Na₂HPO₄4g/L，KH₂PO₄0.5g/L，(NH4)₂SO₄3g/L，pH为7.0。

6.一种产(+)-γ-内酰胺酶重组枯草芽孢杆菌的固定化方法，其特征在于将权利要求5所述的重组转化体进行包埋固定化，获得固定化催化剂。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于其包含如下步骤：将1g冻干细胞充分溶解于10mL去离子水中，与40mL3％的海藻酸钠溶液混合搅拌，通过注射器针头将上述混合液以5cm高度注入1％的氯化钙溶液中立即形成光滑的微球体，并将此固定化小球保持在4℃的上述氯化钙溶液中硬化30min，进而在0.3％的戊二醛溶液中进一步硬化，用生理盐水洗涤后将固定化细胞储存在4℃冰箱中备用。

8.如权利要求5或7所述的固定化细胞作为催化剂在对映选择性拆分γ-内酰胺以制备光学活性γ-内酰胺中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：利用如权利要求5所述重组枯草芽孢杆菌冻干细胞10～15g/L，催化水解100g/Lγ-内酰胺底物，反应条件为温度30℃；pH8～10，优选pH9.0；搅拌转速200～400rpm，优选400rpm。反应结束后，经过二氯甲烷萃取、减压蒸馏和干燥处理，最终获得纯度大于99％的(-)-γ-内酰胺。

10.如权利要求8所述的应用，其特征在于：利用如权利要求7所述的重组枯草芽孢杆菌固定化细胞10～15g/L，水解100g/Lγ-内酰胺底物，反应条件为温度30℃，pH9.0，搅拌转速300rpm，反应结束后分离细胞，重新加入100g/Lγ-内酰胺底物继续反应，连续操作5批后合并反应液，经过二氯甲烷萃取、减压蒸馏和干燥处理，最终获得纯度大于99％的(-)-γ-内酰胺。