[发明专利]一株重组表达γ-内酰胺酶的枯草芽孢杆菌、固定化及应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程和生物工程领域，具体涉及一株异源表达(+)-γ-内酰胺酶的重组枯草芽孢杆菌，其重组细胞的制备和固定化方法，以及应用该催化剂对映选择性水解外消旋γ-内酰胺生产光学纯(-)-γ-内酰胺的应用。

背景技术

(–)-2-氮杂双环-[2,2,1]-庚-5-烯-3-酮(简称文斯内酯，(–)-γ-内酰胺)，是一种碳环核苷类化合物合成的重要手性前体。γ-内酰胺的环戊烯结构，可以使得γ-内酰胺可以参与很多化学反应，比如环氧化，氮丙烷化，氟化，羟基化，硒化，环丙化反应等，因而可以合成多种手性药物，例如抗艾滋病药物阿巴卡伟(Abacavir)、抗甲型流感及禽流感药物帕拉米韦(Peramivir)和新型降糖药物美格列汀(Melogliptin)等。目前，众多制备光学纯γ-内酰胺的方法中(物理法、化学法和生物法)，生物法因为具有反应效率高、立体选择性高、反应条件温和、可重复使用、低能耗、污染少等优点，具有更广泛的应用。微生物酶法拆分外消旋体γ-内酰胺具有良好的应用前景。

γ-内酰胺酶是指能够水解拆分消旋体γ-内酰胺的一类酶。挖掘具有高度立体选择性和催化活力的γ-内酰胺酶，是生物法生产光学纯γ-内酰胺的关键。有报道利用Pseudomonassp.、Rhodococcusequi和Aurobacteriumsp.等全细胞不对称水解γ-内酰胺合成光学纯γ-内酰胺，然而全细胞催化剂的立体选择性并不高。自基因测序技术的革新，海量基因组数据的公开，以及基因工程方法的成熟等，利用基因工程菌异源表达目的γ-内酰胺酶，可以避免野生菌遗传背景复杂和调控困难的难题，从而获得高效的催化剂。此后对γ-内酰胺酶的研究多为采用大肠杆菌Escherichiacoli异源表达γ-内酰胺酶。来源于硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobussolfataricus)的(+)-γ-内酰胺酶研究和应用较为深入，其具有>99％的对映选择性，但其最适反应温度过高(80℃)，利用此酶进行生产过程的能耗很大。通过蛋白比对的方法发现大豆慢生根瘤菌(BradyrhizobiumjaponicumUSDA6)也含有γ-内酰胺酶，然而其产物的光学纯度不高，ee值为96％。王建军等利用基因挖掘的方法，发现了来自大肠杆菌(E.coli)异分支酸酶家族的RutB蛋白，同样具有(+)-γ-内酰胺酶活性，然而其可溶表达较差。目前报道的(+)-γ-内酰胺酶对外消旋γ-内酰胺拆分过程中存在的缺点主要有：(1)(+)-γ-内酰胺酶对外消旋γ-内酰胺拆分的选择性较差；(2)(+)-γ-内酰胺酶的稳定性差；(3)可溶性异源表达差，从而限制了其工业化应用。

本实验室前期筛选了具有(+)-γ-内酰胺酶活性的Delftiasp.CGMCC5755菌株(该菌株于2012年2月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，将该菌株来源的潜在(+)-γ-内酰胺酶在大肠杆菌中异源表达，发现大部分以无活性的包涵体形式存在，可溶性表达较低。本发明通过构建重组质粒pMA5-delm，实现了Delftiasp.CGMCC5755来源的(+)-γ-内酰胺酶基因在枯草芽孢杆菌168中的可溶性表达，对重组转化体进行包埋固定化以提高操作稳定性，进一步利用该重组枯草芽孢杆菌不对称拆分γ-内酰胺，为制备光学纯(-)-γ-内酰胺提供了研究基础。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种可溶性异源表达Delftiasp.CGMCC5755来源的(+)-γ-内酰胺酶的方法，并进一步提高重组细胞的操作稳定性，用于拆分外消旋γ-内酰胺，制备获得光学纯的(-)-γ-内酰胺。

本发明通过下述技术方案以解决上述技术问题：

本发明所述(+)-γ-内酰胺酶的氨基酸序列如序列表中的SEQIDNo.2所示；所述的Delftiasp.保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCC5755，该菌株从土壤中筛选获得，在发明专利(CN102719378A)中有详细说明。

本发明还涉及一种(+)-γ-内酰胺酶基因，其碱基序列如序列表SEQIDNo.1所示，或其编码由序列SEQIDNo.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。