[发明专利]裸鼹鼠VEGFA基因特异性检测引物及检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及裸鼹鼠VEGFA基因检测技术。

背景技术

裸鼹鼠是一种长期生活于与外界气体交换不顺畅、空气中的二氧化碳浓度极高，而氧气含量极低(10％～15％)的洞穴环境中的啮齿类哺乳动物。所以其具有极强的耐受低氧环境的能力，是研究耐低氧机制的良好动物模型。研究表明，肿瘤局部缺血缺氧微环境在肿瘤的发生、发展以及治疗抵抗中具有重要作用。局部低氧微环境是实体肿瘤的基本特征之一，低氧微环境不仅是肿瘤发生恶性转化的始动因素，其还可以诱导肿瘤细胞对放射化疗的抵抗。所以对裸鼹鼠进行耐低氧机制的研究对于解决肿瘤治疗过程中出现的放疗抵抗具有重要意义。研究发现，无论是在个体发育的过程还是在低氧环境应激的过程中，血管的生成严格地依赖于血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)(人的VEGFA的GeneID:7422，小鼠的VEGFA的GeneID:22339)。本发明人所在的实验室前期的研究也发现，在常氧条件下，成年裸鼹鼠组织(脑、肺、心、肝、肾、肌肉)中VEGFAmRNA(GeneID:101702403)水平是成年小鼠的几百倍，从而提示该基因的组成型高表达可能在裸鼹鼠适应低氧环境中发挥重要作用。所以对裸鼹鼠VEGF基因表达水平的检测有利于揭示其可能存在的耐低氧机制。

目前，由于裸鼹鼠繁殖周期长(雌性裸鼹鼠性成熟年龄228天、雄性裸鼹鼠性成熟年龄12个月(分别是小鼠的6.5倍和8.1倍))，裸鼹鼠的妊娠期(68天)是小鼠(21天)的3.2倍)，而且裸鼹鼠属于真社会性生活哺乳动物，在一个群体中只有“女王”雌性裸鼹鼠具有繁殖的机会。并且，野生裸鼹鼠生活于东非埃塞俄比亚、肯尼亚和索马里热带草原的干旱地区，难于捕获。所有的这些原因均造成裸鼹鼠来源数量相对较少，极大地制约了其应用研究。而体细胞培养技术可以很好地解决研究材料来源困难的问题。体外培养细胞具有较强的分裂、增殖能力，适应性强，易培养，性状稳定等特点，广泛地运用于当前的研究当中。

目前，在科学研究当中对VEGFA基因表达的检测主要是通过westernblotting和ELISA检测试剂盒进行基因蛋白表达水平的检测(EisenachPA,etal.(2010)MT1-MMPregulatesVEGF-AexpressionthroughacomplexwithVEGFR-2andSrc.JCellSci.123(Pt23):4182-4193.)但是本方法中需要应用特异性的抗体，而目前没有针对于裸鼹鼠的特定抗体，使用针对其他物种(小鼠、家兔、人类)的抗体存在结合力不足问题，而且某些类型细胞(如皮肤成纤维细胞、肝星形细胞)中VEGFA蛋白表达量较低，westernblotting检测容易检测不到，而且结果不稳定(见图1)。另外，在Real-timePCR检测mRNA表达的过程中，由于设计引物的特异性存在很大差异，从而导致PCR反应容易产生非特异性片段或引物二聚体，即反应的溶解度曲线出现多个峰现象(见图4)。

目前尚无文献报道涉及裸鼹鼠VEGFA基因的特异性检测引物和检测试剂盒。

发明内容

为了解决上述检测技术的不足，本发明提供了VEGFA基因Real-timePCR检测的引物及检测试剂盒。

本发明的第一方面，提供一种裸鼹鼠VEGFA基因特异性检测引物，VEGFA基因Real-timePCR检测引物(2OD)为：

正向引物：5’-TGCCCTTGGTGGGGTTTG-3’(SEQIDNO:1)，

反向引物：5’-CGAGACGCTGGTGGACATC-3’(SEQIDNO:2)。

本发明的第二方面，提供一种裸鼹鼠VEGFA基因的检测试剂盒，包括VEGFA基因Real-timePCR检测引物(2OD)：

正向引物：如SEQIDNO:1所示，

反向引物：如SEQIDNO:2所示。

上述裸鼹鼠VEGFA基因特异性检测试剂盒，还包括：

PremixExTaq^TM5000μl，ROXReferenceDye(50×)200μl。

较佳的，本发明所述的一种裸鼹鼠VEGFA基因的检测试剂盒，包括：

正向引物：如SEQIDNO:1所示，2OD；

反向引物：如SEQIDNO:2所示，2OD；

PremixExTaq^TM，5000μl；