[发明专利]一种微量、高效、稳定的脂肪细胞内甘油三酯检测试剂盒的制备

说明书

本发明公开了一种快速检测脂肪细胞内甘油三酯含量的试剂盒，试剂盒主要包括用丙酮和DMSO作为溶剂的尼罗红工作液、PBS。并提供一种细胞内甘油三酯荧光染色方法。与传统的油红O染色方法相比，此试剂盒的操作方法更简单、耗时短、效率高、通量大、杂质少，更易于用户观察，并可以在短时间内对脂肪细胞内甘油三酯进行定量。因此，此发明更适用于当前脂肪细胞分化的研究工作。

技术领域

本发明涉及一种微量、高效、稳定的脂肪细胞内甘油三酯检测试剂盒，属于生物试剂技术领域。

背景技术

在体外，前脂肪细胞经诱导后（胰岛素、地塞米松、IBMX等）分化为成熟脂肪细胞，分化过程中，细胞胞质中产生甘油三脂并逐渐积聚形成圆形脂滴（lipid droplet）。脂滴的数量和积聚程度可以作为表型值用于评估前体脂肪细胞分化程度。目前，一般使用亲脂染料染色并萃取检测吸光度的方法对成熟脂肪细胞中的脂滴进行定量和定性。

油红O可以将成熟脂肪细胞中的脂滴染成红色，同时，用异丙醇萃取后检测吸光度可以对甘油三酯的多少进行量化。因此，一直以来油红O染色被认为是一种经典的脂滴染色方法。但随着细胞实验技术的快速发展，实验精度的要求也越来越高，经典的油红O染色法也暴露出了自身的一些缺陷，如：染色时细胞需要固定和反复清洗，时间长且易破坏细胞层；油红O工作液在使用前需要过滤，否则染色后会出现油红残渣，影响观察；染色后不易将多余染液洗尽，导致异丙醇萃取后检测出来的吸光度偏高；饱和油红O液体保存太久颜色会变得深黑，影响使用；在长时间操作过程中，挥发的异丙醇会影响实验者的健康。

为了克服油红O染色法的缺陷，本发明使用稳定性较好的荧光染料尼罗红，经发明者多次实验，成功探索出用于成熟脂肪细胞脂滴染色的尼罗红染液。与经典油红O染色相比，尼罗红染色具有步骤简单、通量高、耗时少、对实验者伤害小等特点，且荧光染色更易观察和定量细胞中的脂滴，因此，尼罗红染色更适用于当前脂肪细胞分化的研究工作。

发明内容

在本发明旨在克服经典油红O染色方法的技术缺陷，使用荧光染料尼罗红，提供一种微量、高效、稳定的脂肪细胞内甘油三酯检测试剂盒及其检测方法。该方法操作简易、通量高、耗时少、重复性好、准确率高。

一种微量、高效、稳定的脂肪细胞内甘油三酯检测试剂盒，试剂包括尼罗红工作液。

发明者将丙酮和DMSO作为尼罗红的溶剂，设计表2所示的7个浓度配比组合，并设计尼罗红终浓度为1mg/ml和0.1mg/ml。通过染色已分化完全的猪脂肪细胞，发现0.1mg/ml荧光强度明显弱于1mg/ml（见附图1），因此后续实验浓度定为1mg/ml。配方1至配方7溶解尼罗红使其终浓度为1mg/ml，避光保存一个月后，染色分化15天的猪脂肪细胞，比较分析荧光图片（见附图2-4）和酶标仪定量数据（见附图5），结果发现放置一段时间后配方1/2/3染色效果变差，染色后底层细胞完全卷曲成球状，OD值很低，配方4/6/7在一定程度上也会破坏细胞层的完整性，且OD值差异较大，最终筛选出20%丙酮+80%DMSO是尼罗红最佳溶剂组合。经实验探索后得到最佳尼罗红工作液的配制方法，以配制10ml为例：准确称量10.00mg尼罗红粉末，溶于10ml由20%丙酮和80%DMSO组成的溶剂中，溶解后于4℃避光保存。

表2. 尼罗红溶剂比例设计。

本发明提供一种成熟脂肪细胞内甘油三酯检测方法，包括以下步骤：

步骤1：前脂肪细胞分化到实验所需的时间点后，将孔板取出培养箱，小心吸去培养液，PBS清洗两次，注意不要损坏底层细胞；

步骤2：清洗后，每孔加入对应量的PBS；

步骤3：加入与孔板对应量的尼罗红工作液，室温（20-25℃）避光孵育10min；

步骤4：孔板置于酶标仪中，设置485nm/572nm波长检测荧光强度；